兰坪虫草(Ophiocordyceps lanpingensis)是在云南省兰坪白族普米族自治县发现的线虫草属(Ophiocordyceps)真菌,当地少数民族长期使用兰坪虫草治疗肝脏疾病,效果良好,但药理机制不明确。前期研究表明兰坪虫草多糖(O.lanpingensis polysaccharides,OLP)可能为兰坪虫草的重要活性成分。鉴于天然产物多糖对改善脏器纤维化的有益影响,本研究基于兰坪虫草的传统用法,探讨了兰坪虫草多糖对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的改善作用及其药理机制,为明确兰坪虫草作为民族药开发的潜力和可行性提供科学的理论依据和技术参考。本论文的研究内容主要包括以下三个方面:1.兰坪虫草多糖的分离纯化及组分分析兰坪虫草菌粉经水提、醇沉法得到粗多糖溶液,通过Savage法除去蛋白,透析除去小分子杂质,获得的多糖溶液经阴离子交换柱纯化,冷冻干燥后得到用于后续研究的兰坪虫草多糖。进一步分析兰坪虫草多糖的分子量、单糖组分以及官能团结构。结果表明,兰坪虫草多糖的平均分子量约为3.2×10~5 Da,主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成,摩尔比为13.38:5.31:81.31;红外光谱检测结果显示,兰坪虫草多糖具备多糖的特征吸收峰,其糖环构型可能为吡喃环,是含有α-半乳糖、α-甘露糖和糖醛酸的酸性多糖。2.兰坪虫草多糖对小鼠肝纤维化的改善效果选取50只C57BL/6雄性小鼠,随机分为空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、兰坪虫草多糖低剂量组(OLPL组)、兰坪虫草多糖中剂量组(OLPM组)、兰坪虫草多糖高剂量组(OLPH组),共5组,每组10只。使用四氯化碳诱导小鼠肝纤维化,造模成功后,每天给OLPL、OLPM、OLPH组小鼠分别灌服相应剂量的兰坪虫草多糖(0.3 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)。给药4周后,检测血清中ALT和AST含量;取肝组织进行H&E染色和Masson染色,观察肝组织病理学变化,检测肝脏中HYP、SOD、GSH和MDA含量。结果表明,兰坪虫草多糖能够明显缓解小鼠肝纤维化症状,有效恢复小鼠肝脏的正常形态,逆转四氯化碳造成的肝指数和脾指数上升,减少肝脏中肝细胞坏死、炎性细胞浸润以及纤维增生的情况。此外,兰坪虫草多糖提高了小鼠肝脏中GSH含量、SOD活力;降低了小鼠血清中ALT、AST水平以及肝脏中HYP和MDA含量。以上研究结果证明,兰坪虫草多糖对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化确实具有较好的改善作用。3.兰坪虫草多糖改善小鼠肝纤维化的机制研究采用实时荧光定量PCR检测肝组织炎症信号通路相关因子TLR2、TLR4、My D88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6和IL-10的m RNA表达水平,并进一步探讨与纤维化形成直接相关的TGF-β1、Col-1、α-SMA和Smad3的m RNA表达水平;采用免疫组织化学方法测定小鼠肝脏中TGF-β1、Col-1蛋白表达水平;用蛋白免疫印迹(Western Blot)的方法检测炎症相关信号通路蛋白TLR2、TLR4、My D88、NF-κB的蛋白表达量,以及细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Active-Caspase 3、Caspase 9的表达量;用TUNEL染色法观察肝细胞凋亡情况。结果表明,兰坪虫草多糖显著降低了纤维化肝脏中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6、TGF-β1、Col-1、α-SMA以及Smad3的m RNA表达水平,提高了IL-10的m RNA表达水平;明显抑制了肝脏中TLR2、TLR4、My D88、NF-κB、TGF-β1、Col-1的蛋白表达。说明兰坪虫草多糖可有效改善四氯化碳引起的肝脏炎症反应和肝纤维化状态。此外,兰坪虫草多糖显著减少了肝纤维化小鼠肝组织中的TUNEL阳性细胞,降低了Bax、Caspase 3、Active-Caspase 3、Caspase 9蛋白表达量,提高了Bcl-2蛋白表达量,表明兰坪虫草多糖可能通过线粒体凋亡途径影响肝细胞凋亡,从而缓解肝纤维化的发展。综合上述,本研究发现兰坪虫草多糖可以有效改善四氯化碳导致的小鼠肝纤维化,其可能的药理机制包括兰坪虫草多糖缓解了肝组织的氧化应激状态和炎症反应,抑制了细胞纤维化过程和细胞凋亡,进而实现肝纤维化状态的逆转,逐步恢复正常。