莲草直胸跳甲寄主专一性相关羧酸酯酶基因的筛选及其特性研究

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莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila Selman & Vogts,是恶性杂草喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides (Mart.) Griseb的专食性天敌,是目前防治喜旱莲子草最有效的生物防治措施,目前已在美国、澳大利亚、中国等国家引进并推广。莲草直胸跳甲的专食性研究有很多,然而目前并没有定论。昆虫体内解毒酶系的作用涉及生长、发育、取食过程,它对外来物质的代谢是昆虫对取食植物耐受性的原因,羧酸酯酶是昆虫解毒酶的一种,为了解羧酸酯酶在莲草直胸跳甲专一性取食过程中是否发挥作用,本文利用高通量测序和数字基因表达谱技术,得到不同处理下莲草直胸跳甲体内差异表达的羧酸酯酶基因,对其进行聚类和特性分析,同时利用荧光定量PCR方法检测差异基因表达,从分子水平论述羧酸酯酶的表达变化与取食不同植物之间的关系,为阐明莲草直胸跳甲取食专一性提供理论依据。研究主要结果如下:1.利用转录组测序技术和数字基因表达谱技术,得到经不同处理后差异表达基因的碱基序列,其中羧酸酯酶基因有两条,分别为Unigene9421(1647bp)和CL4865.contigl (1328bp),其中Unigene9421为全长序列,CL4865.contigl在5’端有部分缺失。CarE9421和CarE4865最长的ORF分别为999bp和330bp, CarE9421编码的多肽链含548个氨基酸,CarE4865编码的多肽链含411个氨基酸,二者都是亲水蛋白。二级结构中都是α螺旋所占比例较高,p折叠相对较少。CarE9421和CarE4865在细胞中的定位是细胞质,CarE4865没有信号肽,CarE9421含有信号肽。2.对于全长序列CarE9421进行了重测序验证,共有三处碱基与转录组测序结果不同,最终采用重测序的结果代替转录组测序结果,三处碱基分别是第563个碱基T代换C,第704个碱基T代换A,.第1155个碱基T代换A。3.荧光定量两个基因在莲草直胸跳甲取食不同植物后其表达量都有极显著差异(P<0.01),与饥饿处理相比,莲草直胸跳甲取食喜旱莲子草后CarE9421基因表达量显著增高,差异倍数为13.7倍;而CarE4865基因在莲草直胸跳甲取食莙(?)和喜旱莲子草后其表达量显著降低,差异倍数为0.28倍和0.60倍。4.羧酸酯酶活性以乙酸-1-萘酯为底物检测取食喜旱莲子草、若(?)和饥饿后莲草直胸跳甲羧酸酯酶的活性,结果表明:取食喜旱莲子草后莲草直胸跳甲羧酸酯酶活性与取食莙(?)和饥饿后相比,酶活性显著升高,为饥饿处理的2.3倍;取食莙(?)与饥饿处理之间羧酸酯酶活性没有显著差异。
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