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原发性肝癌(Primary carcinoma of liver)是我国常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,病情进展快,治疗效果差,病死率高居世界癌症病例中第三位。此病常合并肝硬化,并早期即在肝内扩散,由于缺乏特异性症状,难以早期发现。除部分早期患者可以进行手术治疗外,中晚期患者的治疗手段没有新的突破。目前肝癌患者的平均生存期仅为3～6个月,3年生存率低于13%。近年来原发性肝癌发病率呈进一步上升趋势,因此进一步探讨肝癌治疗的有效药物和方法具有极为重要的临床意义。信号转导通路异常与肿瘤的发生、发展关系密切。在许多肿瘤如乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中发现磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt信号转导通路的激活,它的活化导致肿瘤细胞增殖过度、凋亡受抑。PI3K是一种与细胞内信号传导有关的第二信使,是由两部分组成的异源性二聚体,其中p85是调节亚单位,p110是催化亚单位。p85亚单位包含两个SH2功能域和一个SH3功能域。当细胞被生长因子刺激后,p85亚单位的SH2功能域与酪氨酸磷酸化受体结合,进而将p85·p110复合体结合于细胞膜内侧以转导信息。AKt又称蛋白激酶B(protein kinase B, PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞生存通路PI3K/Akt的关键分子,在细胞内信号转导系统中位于PI3K的下游,主要通过PI3K激活。AKt的活化依靠两个位点的磷酸化:一个是激酶活性区,另一个是羧基端疏水区。激活后的AKt能使底物种的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化而发挥广泛的生物学效应,包括抗凋亡、促进细胞增殖的作用。研究发现肝癌细胞中存在PI3K及其下游信号分子AKt表达水平和活性异常改变,因此阻断或抑制PI3K/AKt信号转导有可能抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。三羟异黄酮(4,5,7-三羟异黄酮),是大豆中主要的异黄酮成份,是一种多效的天然活性物质,对多种肿瘤具有抑制作用,其抗癌机制可能与周期阻滞、诱导凋亡以及调节信号转导通路等多种途径有关。业已研究表明,三羟异黄酮可以影响ERK1/2MAPK信号转导通路,抑制乳腺癌细胞增殖。目前,关于三羟异黄酮对肝癌细胞PI3K/Akt信号转导通路的影响研究甚少。因此,本研究旨在通过体外肝癌细胞培养,研究三羟异黄酮对人肝癌SMMC-7721细胞PI3K/Akt信号转导途径的影响,及该通路在三羟异黄酮诱导细胞凋亡中的作用,进一步探讨三羟异黄酮抗肿瘤作用的机理,为肝癌的治疗提供新的思路。目的:探讨三羟异黄酮对人肝癌SMMC-7721细胞PI3K/Akt信号转导通路的影响,及该通路在三羟异黄酮诱导细胞凋亡中的作用。方法:应用体外细胞培养技术,采用Western blot方法检测三羟异黄酮对人肝癌SMMC-7721细胞Akt、磷酸化Akt(p-Akt)和PI3K蛋白表达的影响;采用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:①三羟异黄酮对SMMC-7721细胞Akt蛋白表达的影响:Western blot显示:5、25、50μmol·L-1三羟异黄酮干预SMMC-7721细胞后,与对照组比较,细胞内Akt蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。50μmol·L-1三羟异黄酮作用SMMC-7721细胞24h～72h,细胞Akt蛋白表达与0h相比,无显著差异(P>0.05)。这说明三羟异黄酮并不抑制Akt蛋白的表达量。②三羟异黄酮抑制SMMC-7721细胞磷酸化Akt蛋白表达。Western blot方法分析示:5μmol·L-1三羟异黄酮组p-Akt表达与对照组比较无明显差异(P>0.05);25、50μmol·L-1三羟异黄酮组p-Akt表达明显下降(P<0.01)。三羟异黄酮干预浓度越高,p-Akt蛋白表达下降趋势越明显,呈剂量依赖性。50μmol·L-1三羟异黄酮干预SMMC-7721细胞24h、48h、72h,与0h相比,三羟异黄酮干预时间越长,p-Akt蛋白表达下降趋势越明显,呈时间依赖性。③三羟异黄酮对SMMC-7721细胞PI3K-p85蛋白表达的影响:Western blot显示,50μmol·L-1三羟异黄酮作用SMMC-7721细胞24h～72h,细胞PI3K-p85蛋白表达与0h相比,无显著差异(P>0.05)。5、25、50μmol·L-1三羟异黄酮干预SMMC-7721细胞后,与对照组比较,细胞内PI3K-p85蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。三羟异黄酮对PI3K-p85蛋白的表达量无影响。④三羟异黄酮对SMMC-7721细胞的凋亡诱导作用:流式细胞仪检测5～50μmol·L-1三羟异黄酮作用48h后,细胞凋亡率逐渐增加,出现了明显的亚二倍体凋亡峰。25、50μmol·L-1三羟异黄酮作用组与对照组比较,细胞凋亡率分别为5.52%±0.53% vs 2.48%±0.35%、9.44%±0.51% vs 2.48%±0.35%,均有差异均有统计学意义(P<0.01),且两浓度组间的差异有显著性(P<0.01),而5μmol·L-1三羟异黄酮作用组与对照组比较无明显差异,说明随三羟异黄酮浓度的增加,细胞凋亡率细胞凋亡率逐渐增加,呈剂量依赖性。⑤三羟异黄酮作用后AKt的磷酸化与人肝癌细胞SMMC-7721凋亡率的相关分析:两者之间呈负相关,相关系数为(r=-0.919, P<0.01)。结论:三羟异黄酮能够抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞PI3K/Akt信号转导通路Akt蛋白的磷酸化水平,并呈时间和剂量依赖性;三羟异黄酮可以诱导人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡可能部分是通过抑制PI3K/Akt信号转导通路实现的。