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目的:1.研究micro RNA-146a对人神经胶质瘤U251细胞耐药株的作用。2.探讨Notch1基因与micro RNA-146a在人胶质瘤耐药性中的相关性。方法:1.通过慢病毒包装、转染、筛选,分别获得高表达NICD的U251细胞株及其空载plvx的U251细胞株,并通过Western Blotting及免疫荧光染色进行鉴定。2.micro RNA芯片检测和筛选NICD高表达和空载plvx的U251细胞及对照U251细胞中差异性表达的micro RNAs。3.RT-q PCR检测鉴定NICD高表达和空载plvx的U251细胞及对照U251细胞中mi RNA-146a的表达情况。4.釆用替莫唑胺(TMZ)浓度递增的作用方式诱导U251细胞,初始诱导剂量0.25μg/ml(0.2875μM),最高诱导剂量为20μg/ml(103.0μM),获得稳定的对TMZ耐药的U251细胞,命名为U251TR,用CCK-8法检测U251,U251TR的细胞增殖抑制率,计算半数抑制浓度IC50及耐药指数(RF)。5.RT-q PCR检测U251TR及其对照U251细胞中mi RNA-146a的表达情况。6.用脂质体介导的转染方法将mi R-146a-mimics转入U251TR,称为转染组细胞(U251TR-mimics),荧光显微法检测转染组转染效率,RT-q PCR检测U251TR及U251TR-mimics中mi R-146a的表达情况,CCK-8法检测U251TR-mimics细胞增殖抑制率,计算IC50及RF。7.Western Blotting检测U251,U251TR及U251TR-mimics细胞中Notch1基因的表达情况。 8.通过生物信息学预测靶向调控Notch1的mi RNA-146a,然后通过双荧光素酶报告基因实验及Western blotting实验对mi R-146a进行靶标的验证。结果:1.成功建立了高表达NICD和空载plvx的U251细胞株。2.Micro RNA芯片结果显示NICD高表达的U251细胞中mi RNA-146a与对照组相比明显降低(P<0.05)。3.成功建立了对TMZ耐药的U251TR,U251TR细胞IC50(320.68μM)是未经诱导U251细胞IC50(30.54μM)的10.5倍(P<0.05),其耐药指数(RF)约为11。4.RT-q PCR结果显示,mi R-146a在NICD高表达组细胞及其对照组细胞中的表达情况与micro RNA芯片结果一致;RT-q PCR显示耐药株U251TR中mi R-146a相对表达量低于U251(P<0.05)。5.转染组mi R-146a-mimics的转染效率在90%以上;转染组细胞U251TR-mimics IC50(160.79μM)是未经诱导的U251细胞IC50(30.54μM)的5.26倍(P<0.05),其耐药指数(RF)约为5。6.双荧光素酶报告基因实验和Western blotting实验均显示mi R-146a-5p作用后,荧光素酶活性及Notch1下调明显(P<0.05)。结论:成功构建了对TMZ耐药的U251TR细胞,其耐药指数(RF)约为10,U251TR细胞中mi R-146a相对表达量低于U251细胞;将mi R-146a-mimics转入U251TR细胞后,其耐药指数下降。双荧光素酶报告基因和Western blotting结果均显示mi R-146a靶向调控Notch1。mi RNA-146a可能通过Notch1信号通路在人胶质瘤细胞U251耐药形成机制中发挥一定的作用。