[研究背景]原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球发病率最高的恶性肿瘤之一,也是引起人类癌症死亡的主要病因之一。中国是HCC的高发地区,全世界1/2以上的HCC患者发生在中国。目前HCC的发病仍呈增长趋势,是21世纪全球尤其是中国面临的主要公共健康问题。肝癌的发生、发展是一个极其复杂的生物学过程,涉及许多环境和遗传性危险因素所引起的异常活化或失控的分子和细胞信号传导通路、促癌基因和抗癌基因表达的失衡、以及肝癌干细胞分化等多种机制。传统的治疗手段,如外科手术切除、介入性栓塞、化学治疗和放射治疗,存在治愈率低和复发转移率高的不足;而新兴的分子靶向药物,如多酪氨酸激酶抑制剂、程序性细胞死亡蛋白-1拮抗剂,因受到HCC的分子发病机制复杂性以及HCC异质性的局限性而无法获得满意的效果,故揭示HCC深层次的信号通路,寻找新的治疗靶点,成为近年来HCC研究的热点和难点。固有免疫或天然免疫或先天性免疫,作为一种天然免疫防御功能,是生物体进化过程中逐步演变进化的产物,它通过特定的模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或危险相关的分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs),成为宿主抵御和清除各种入侵病原体的一线防御屏障。同时,它也参与了包括各种癌症在内的众多病理生理现象的发生发展过程。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及DNA感受器等数种经典PRRs参与精细调控固有免疫反应的启动和调节。PRRs及其调节因子在不同的组织、不同的细胞类型和不同的病理生理条件下,可产生抑癌或促癌的作用,部分PRRs可诱导抗癌的免疫反应来抑制肿瘤的发展,而失控的固有免疫信号传导通路则是癌细胞增殖和逃避免疫监视的重要机制。慢性炎症反应是癌症发生和发展的重要驱动因素,通过固有免疫信号传导通路激活固有免疫反应是联系慢性炎症和癌症之间的桥梁。近数十年来的研究发现固有免疫及PRRs在包括HCC在内的各种肿瘤的发生和进展中发挥关键性作用。PRRs中的DNA感受器——HIN-200蛋白家族可通过感知病原体DNA或损伤性DNA,诱导炎性复合体(inflammasome)形成,参与对细胞分化、细胞增殖、细胞衰老、细胞凋亡的调节,并在抑制肿瘤和病毒复制、自身免疫性疾病中发挥重要作用。IFI16是干扰素诱导的、人类HIN-200细胞核蛋白家族成员,在肿瘤中作用机制复杂,在多数肿瘤中被认为是一个抑制肿瘤的转录调节因子,但也可能具有促肿瘤发生的作用。同样,IFI16在肝癌中的研究较少且存在争议。而且,IFI16可在数个与恶性肿瘤密切相关的病毒感染(如卡波西肉瘤相关疱疹病毒、淋巴瘤和鼻咽癌密切相关的EB病毒)中,IFI16可促进非典型的炎性复合体形成。因此,阐明固有免疫和PRRs及其信号传导通路在各种肿瘤(包括HCC)中作用的分子机制,将为人类肿瘤(包括HCC)的治疗带来新的治疗靶点和治疗策略。[研究目的]IFI16在HCC中的研究较少,因此其在HCC中起抑癌或促癌的作用还存在争议;同时,IFI16炎性复合体及其通路是否参与了 HCC的发病过程仍不清楚。故本研究拟通过探索IFI16在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达情况,并通过体外实验揭示IFI16对恶性肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性行为的影响;同时,本研究拟对相关信号通路相关分子进行检测,并通过对信号传导通路的干预,验证IFI16与信号通路的直接相关性,进一步阐明HCC发病的分子机制,为HCC治疗寻找新的分子靶点。[材料和方法]1.收集20位原发性肝细胞肝癌患者的肝癌及癌旁组织标本,进行苏木精和伊红染色(H&E染色)检测组织病理情况;免疫组织化学法检测IFI16在肝癌组织及癌旁组织中的表达及定位情况;并采用实时定量聚合酶链反应方法(qRT-PCR)和免疫印迹法(Western blot法),检测肝癌及癌旁组织中IFI16在mRNA和蛋白水平表达差异。2.培养人类肝癌细胞系 HepG2、HL-7702、Huh7、Bel-7402、SMMC772 和正常肝细胞系L-02,采用Western blot和qRT-PCR方法测定肝癌细胞系和正常肝细胞系中IFI16蛋白和mRNA的表达。3.选择两株IFI16表达相对较低的肝癌细胞株(Huh-7和SMMC-7721)进行后续实验:构建pcDNA3.1-IFI16过表达载体并转染上述两种肝癌细胞株,采用Western blot法和qRT-PCR法测定转染后肝癌细胞株中IFI16蛋白及mRNA的表达水平,验证转染后效率。4.采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测IFI16过表达对肝癌细胞株Huh-7和SMMC-7721的细胞活性的影响。5.采用克隆形成试验、细胞划痕试验(Wound healing assay)和小室实验(Transwell assay),分别检测IFI16过表达对肝癌细胞株(Huh-7细胞和SMMC-7721细胞)细胞克隆形成能力、迁移以及侵袭能力的影响;并结合p53抑制剂PFTα和炎性复合物抑制剂AC-YVAD-CMK干预,检测其对IFI16过表达肝癌细胞株的细胞克隆形成能力、迁移以及侵袭能力的影响。6.采用流式细胞仪分析过表达IFI16的肝癌细胞株(Huh-7细胞和SMMC-7721细胞)以及接受p53抑制剂PFTα、炎性复合物抑制剂AC-YVAD-CMK干预处理后的上述两种肝癌细胞株的细胞凋亡情况。7.采用Western blot法检测过表达IFI16的肝癌细胞株(Huh-7细胞和SMMC-7721细胞)中,p53蛋白、p-p53ser15蛋白及其靶基因p21蛋白的表达情况和炎性复合体相关成分(ASC、pro-caspase-1、caspase-1)和下游分子(pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18、IL-18)的蛋白表达水平,以及接受炎性复合体抑制剂AC-YVAD-CMK处理的上述两株肝癌细胞株中炎性复合体相关成分(ASC、pro-caspase-1、caspase-1)和下游分子(pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18、IL-18)的蛋白表达水平。8.采用ELSIA法测定过表达IFI16的肝癌细胞株(Huh-7细胞和SMMC-7721细胞)以及接受p53抑制剂PFTα、炎性复合物抑制剂AC-YVAD-CMK的干预处理后的上述两种肝癌细胞株中IL-1β、IL-18的表达水平,采用LDH试剂盒检测各组细胞不同条件下LDH的表达水平。9.采用Balb/c裸鼠,予以皮下注射肝癌细胞株和过表达IFI16的肝癌细胞株,建立异种移植动物模型,并采用p53抑制剂和炎性复合体抑制剂进行干预,测定各组动物瘤体生长情况;采集瘤体标本,免疫组织化学法测定各组动物肿瘤中IFI16、p53和Ki67的表达水平。[结果]1.IFI16蛋白的表达主要定位于肝细胞核内,且肝癌组织中IFI16的表达水平显著低于癌旁组织中IFI16表达水平(p<0.01,p<0.001);同样,肝细胞肝癌细胞系中IFI16的表达水平显著低于正常肝细胞系的表达水平(P<0.05;P<0.01)。2.与阴性对照组比较,肝癌细胞系Huh-7和SMMC-7721在转染IFI16过表达载体72小时后,细胞活性均显著下降(p<0.05);而且,克隆形成试验、细胞划痕试验和Transwell实验显示,IFI16的过表达能显著抑制肝癌细胞株的细胞克隆形成能力、迁移以及侵袭能力(p<0.05,p<0.01)。3.与阴性对照组相比,肝癌细胞系在转染IFI16过表达载体48 h后,细胞凋亡水平呈显著增加趋势(p<0.05)。4.肝癌细胞系IFI16过表达72h时,p53、p-p53ser15及其靶基因p21蛋白的表达水平较对照组显著增高(p<0.05)。而采用p53抑制剂PFTα处理过表达IFI16的肝癌细胞株后,细胞凋亡水平较只进行IFI16过表达的肝癌细胞株显著下降(p<0.05),并且肝癌细胞的克隆形成能力、迁移以及侵袭能力均得到显著恢复(p<0.05)。5.Western blots法分析显示,与对照组相比,IFI16过表达的肝癌细胞株(Huh-7细胞和SMMC-7721细胞)中炎性复合体相关成分(ASC、pro-caspase-1、caspase-1)和下游分子(pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18、IL-18)的蛋白表达水平均显著增高(p<0.05);而接受炎性复合体抑制剂AC-YVAD-CMK处理后,AC-YVAD-CMK处理组中炎性复合体相关成分(ASC、pro-caspase-1,、caspase-1)和下游分子(pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18、IL-18)的蛋白表达水平显著下降(p<0.05)。6.流式细胞仪分析显示,与对照组相比较,IFI16过表达能显著促进肝癌细胞株中细胞凋亡(p<0.01),而与过表达IFI16的肝癌细胞株相比较,加入炎性复合物抑制剂AC-YVAD-CMK干预后,细胞凋亡水平显著下降(P<0.05);同时,结果显示,过表达IFI16的肝癌细胞克隆形成能力、迁移以及侵袭能力与对照组相比较,均显著受到抑制(p<0.05,p<0.01),但经炎性复合体抑制剂AC-YVAD-CMK处理后的过表达IFI16的肝癌细胞株,其细胞克隆形成能力、迁移以及侵袭能力均出现不同程度的回调(p<0.05)。7.在两种肝癌细胞株(Huh-7细胞和SMMC-7721细胞)中,加入IFI16-炎性复合物抑制剂AC-YVAD-CMK,培养48小时后,ELSIA方法检测IL-1β、IL-18和LDH水平,发现显著抵消了过表达IFI16所诱发的IL-1β、IL-18和LDH 水平(p<0.01或<0.05)。8.在异种移植动物模型中,Balb/c裸鼠皮下注射过表达IFI16的肝癌细胞株所形成的实体瘤体积及体积增长速度均显著小于对照组(p<0.05),而经p53抑制剂PFTα和炎性复合体抑制剂AC-YVAD-CMK联合处理后,瘤体体积及增长速度出现显著逆转(p<0.05);免疫组化分析显示,过表达IFI16组的裸鼠瘤体中IFI16、p53表达较对照组显著增高(p<0.05),Ki67表达显著降低(p<0.01),而采用p53和炎性复合体抑制剂的联合干预能够显著降低IFI16、p53在实体瘤中的表达(p<0.05),显著增加Ki67在实体瘤中表达(p<0.05)。[结论]1、IFI16在肝细胞肝癌组织中及人类肝细胞肝癌细胞系中表达下调,提示IFI16表达缺失或功能抑制可能参与了 HCC的发病机制。2、在肝细胞肝癌细胞中,IFI16可通过激活肿瘤细胞炎性复合体活性,进而抑制肿瘤迁移、侵袭和增殖等恶性行为;这种抑癌效应,会因为炎性复合体抑制剂的存在,而受到显著的抑制。3、在肝细胞肝癌细胞中,IFI16所介导的抑癌作用,是依赖p53/p21通路来促进炎性复合体信号来发挥其抗肿瘤活性的;对该信号通路的抑制,能够逆转因IFI16所介导的抑癌效应。4、在体内实验中,过表达IFI16可抑制HCC肿瘤的生长,p53抑制剂和炎性复合体抑制剂的存在又能阻断IFI16所引起的抑癌作用。表明IFI16通过p53/p21通路激活炎性复合体发挥抑癌作用,并在肝癌发生和发展调控中发挥重要的作用。