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研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌的主要组织学类型,特点为发病率高、进展快且恶性程度高,一经发现常为晚期。但针对晚期肝癌的治疗手段非常有限,传统放、化疗的效果均不理想,易发生复发和转移。所以寻找新的HCC治疗手段十分重要。肿瘤的免疫治疗正逐步兴起,出现了许多基于机体免疫的抗肿瘤治疗方法,树突状细胞疗法就是其中之一。树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）被认为是体内最有效的抗原提呈细胞,它能够识别并呈递肿瘤相关抗原,启动相应的抗肿瘤进程。虽然一些研究已经证明DCs具有抗肿瘤的作用,但临床使用效果却不尽人意。运用DCs治疗肿瘤的关键是寻找更有效的肿瘤抗原,能够强力刺激DCs活化使其成熟,介导机体内抗肿瘤免疫的发生。许多恶性肿瘤在生长过程中由于营养物质缺乏、氧化应激等多种因素影响,使细胞处于内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）状态,激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Reaction,UPR）。一定程度的ERS可以促进肿瘤细胞生长、抑制抗肿瘤免疫和诱导肿瘤细胞耐药。ERS的发生在肿瘤细胞中具有双向性作用,其对DCs抗肿瘤作用的影响尚不完全明确。外泌体（exosomes,Exo）特指直径在40-100nm的微小囊泡。携带大量生物学信息,是细胞间信息交流的重要工具。肿瘤细胞外泌体中包含大量肿瘤抗原,可能为肿瘤的预防和治疗提供新的思路。本研究将探讨肿瘤细胞内质网应激后释放的外泌体对DCs功能的影响。目的（1）探讨ERS肝癌细胞来源的外泌体对DC细胞活化和淋巴细胞增殖的影响。（2）通过动物实验研究ERS肝癌细胞来源的外泌体刺激的DC细胞对小鼠成瘤能力的影响和对体内淋巴细胞亚群及细胞因子水平的影响。方法（1）将生长状态良好的hepa1-6细胞与不同浓度的衣霉素（Tunicamycin,TM）（1.25、2.5、5umol/L）共培养12、24、48h,用western-blot检测细胞中ERS相关蛋白的表达情况。选定作用明显且细胞状态较好的刺激条件作为诱导细胞ERS的实验条件。（2）用Exo Quick-TC试剂盒从未刺激的hepa1-6细胞上清中提取外泌体,标记为Exo-Con;用TM刺激hepa1-6细胞发生ERS,再用Exo Quick-TC试剂盒提取其外泌体,标记为Exo-TM。用冷冻电镜观察其形态,再用western-blot检测其中外CD63、TSG101、Calnexin的表达情况。（3）细胞实验分为对照组和实验组。对照组分为阴性对照（Mock组）和阳性对照（LPS组）,Mock组DCs不作处理,LPS组DCs与LPS共培养48h使细胞活化。实验组分为Con组和TM组,DCs分别与等量Exo-Con和Exo-TM共培养48h。再用流式细胞术检测DCs表面分子水平,观察DCs活化情况。最后将处理后的DCs和鼠淋巴细胞共培养,用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（Carboxyfluorescein Diacetate Succinimide,CFSE）染色观淋巴细胞增值情况。（4）动物实验分为对照组和实验组。实验组分为i DC组、Con组和TM组,每组各5只小鼠。实验组小鼠分别尾静脉注射100ul含有1×106个未经处理的DCs、与Exo-Con共培养48h的DCs和与Exo-TM共培养48h的DCs;对照组（Blank组）仅尾静脉注射100ul无菌PBS。每隔一周注射一次,共三次。注射三次后间隔一周,每只小鼠皮下注射7×105个hepa1-6细胞,观察DCs对小鼠成瘤的影响。（5）两周后处死小鼠剥取肿瘤测量大小。收集小鼠脾脏和淋巴结中的淋巴细胞,用流式细胞术检测实验组与对照组小鼠淋巴细胞亚群的变化情况,最后检测不同组小鼠血清中INF-γ的表达水平。结果（1）western-blot结果表明肝癌细胞株hepa1-6中ERS相关蛋白在2.5umol TM刺激24h时上调最为明显,故选择2.5umol TM刺激24h作为刺激条件。（2）电镜下可以观察到直径40-100nm的盘状双层膜结构的小囊泡;western-blot检测其中表达CD63和TSG101但不表达Calnexin,符合文献报道。（3）流式细胞术结果显示对阳性对照组DCs表面分子明显上调,说明成功诱导了DCs的活化。实验组中TM组DCs表面分子显著上调,细胞明显活化;TM组DCs活化程度最高。CFSE染色结果显示Con组和TM组DCs与对照组相比能够明显诱导淋巴细胞增殖（p<0.01）,但以TM组效果最明显。（4）动物实验结果显示:Blank组五只小鼠均荷瘤成功且瘤体较大;i DC组中有三只小鼠荷瘤成功,瘤体小;Con组中两只小鼠荷瘤成功,瘤体小。i DC组与Con组瘤体大小与Blank组相比明显缩小（p<0.01）;TM组中五只小鼠均未荷瘤成功。结果表明荷瘤前注射DCs可以抑制肿瘤细胞成瘤能力,以TM组的作用最为显著。（5）流式细胞术结果显示TM组小鼠脾脏和淋巴结中淋巴细胞CD8+/CD4+比例与对照组相比明显上升（p<0.05）,说明TM组的DCs可以刺激T淋巴细胞增殖,而TM组小鼠血清中INF-γ水平与Blank组相比明显升高（p<0.05）。结论（1）ERS肝癌细胞来源的外泌体能够刺激DCs活化,诱导淋巴细胞增殖。（2）动物实验结果表明ERS肝癌细胞来源的外泌体刺激的DCs能够激活体内抗肿瘤免疫。注射DCs可以显著抑制肿瘤细胞成瘤能力,使小鼠脾脏和淋巴结中淋巴细胞CD8+/CD4+比例上升,血清中INF-γ水平升高。