研究背景大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,其发病率居男性肿瘤第三位,女性肿瘤第二位。近年来,随着干细胞领域的发展和对肿瘤的不断深入研究,人们发现肿瘤存在各种不同克隆的癌细胞,这些不同亚群细胞之间存在不同分工,其分裂增殖能力也大相径庭。其中有一小群细胞与正常干细胞存在许多共性,包括分化、自我更新能力等,多处于休眠状态或分裂缓慢,并有强的致瘤性和对治疗的抵抗,其活性受Hedghog、Wnt和BMP等信号通路调节,因此将其命名为肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC).尽管这部分CSC细胞数量极少,但其对传统的放化疗非但不敏感,反而可以在治疗后被富集,因此CSC的存在被认为目前许多肿瘤无法治愈的根本所在。与生殖干细胞不同,成体干细胞包括CSC多处于静息状态,后者即静息肿瘤干细胞(quiescent cancer stem cell, QCSC),这种近似于休眠的低代谢状态造成其对放化疗不敏感,一旦被重新“唤醒”迅速增殖分裂造成肿瘤复发。相比于身体其他器官,肠道有其特殊性。目前认为肠道中同时存在快速分裂与休眠状态两种干细胞,前者维持着肠道上皮细胞的频繁更新,而对后者的认识直到近年才逐渐明朗。研究人员发现正常情况下两种细胞均可分化为各类肠道上皮细胞,但在一定剂量放射杀伤后,只有后者能够重建肠道上皮,并且部分分化为快速分裂的干细胞。由此可见在肠道中,静息干细胞才是根源。目前对于大肠癌静息肿瘤干细胞(quiescent colon cancer stem cell, QCCSC)的研究鲜有报道,根据CSC理论,我们有理由推测QCCSC是肿瘤发生、耐药和转移复发的重要原因。如何有效清除QCSC仍是迄今肿瘤研究的热点与难点。有限的研究表明CSC可特异性高表达一些抗原,使其更容易受到杀伤性免疫细胞及相关细胞因子的攻击。有报道δYT细胞能特异性杀伤卵巢癌及大肠癌CSC; QCSC特异性高表达NK细胞相关配体,从而更容易受到NK细胞的攻击；IFN-α/β能特异性杀伤卵巢癌及胶质瘤CSC。以上证据表明,免疫治疗可能成为CSC靶向治疗的一种新的策略。从时间维度上来看,静息只是一个相对的细胞周期状态。细胞从活跃分裂期转为分裂停滞往往存在四个结局：老化,凋亡,分化和静息。因此并非所有肿瘤细胞从分裂期停滞后就等同于QCSC,而只有具有干细胞特征的一小群细胞才能可逆性的在静息期与活跃分裂期之间转换。虽然QCSC可能只是普通肿瘤细胞的前一个状态,但是大量研究表明两者在代谢,基因表达等方面有着巨大的差别,而这种差别很大程度上与表观修饰有关,其中microRNA是一个重要的表观调控机制。microRNA为长度约18-25个碱基的单链非编码RNA,可在基因转录后阶段促使靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA的蛋白质翻译过程。miRNA不仅在胚胎发育阶段起着重要作用,疾病情况下尤其在肿瘤发生、发展过程中,以及对CSC的生物学行为调控同样发挥着明显的生物学作用。如miR-155可抑制E-caderin,上调ZEB1等促进肿瘤转移增殖；let-7家族则可通过下调STAT3信号通路抑制肿瘤；miR-200c可以抑制BMI1调控乳腺癌干细胞的自我更新；miR-20a通过上调AKT信号通路及抑制PTEN促进CSC的耐药及EMT。然而microRNA在QCSC中的调控机制目前尚不明了。CSC在肿瘤组织中处于核心位置,而QCSC则是其中非常重要的组成部分,具有明显区别于普通肿瘤细胞的恶性生物学特性,其与普通肿瘤细胞之间的差异分子亦可成为肿瘤发生发展中的关键分子。研究QCCSC的靶向清除与miRNA调控机制不仅可进一步探究大肠癌发生发展中表观遗传学调控机制,也可为大肠癌治疗提供新的靶点和思路。研究方法本课题利用原代大肠癌细胞及ATCC标准细胞系,首先通过PKH细胞膜染色结合无血清克隆球培养体系分离出静息大肠癌细胞,并通过一系列功能学实验(耐药性,克隆球形成能力,动物体内成瘤实验,干细胞基因检测)鉴定其CSC特性；在此基础上,通过凋亡检测评价了QCCSC与其他亚群细胞对IFN-y的敏感性；结合实验结果,比较不同亚群细胞IFN-yR的表达差异,同时通过蛋白免疫印迹实验,激光共聚焦等方法检测了不同亚群细胞在IFN-γ刺激下凋亡通路的激活状况。之后进一步通过对QCCSC与其他亚群的miRNA芯片比较,结合生物信息学分析,发现miR-4666-3p在QCCSC显著低表达于其他亚群细胞,同时通过蛋白质免疫印迹,荧光素双报告基因等方法验证IFN-yR是miR-4666-3p的靶基因。最后,我们构建了miR-4666-3p高表达／抑制细胞系,通过克隆球形成,干细胞基因检测,动物成瘤等实验检测了miR-4666-3p对QCCSC自我更新及分化的影响。研究结果1. PKHhi大肠癌细胞具有低增殖速度及肿瘤干细胞特征结合PKH细胞膜染色及无血清克隆球培养技术,我们将PKHhi细胞(荧光值>103)定义为静息大肠癌细胞,其余细胞根据荧光强度分为PKHlow(荧光值102-103)与PKHneg：荧光值<102)亚群。通过PY-Hoeschest33342双染流式细胞检测(flow cytometry,FCM)分析,PKHhi细胞大部分处于GO期(78.07±1.98%),而PKHlow与PKHneg细胞则大部分处于分裂期或分裂前期。再通过PKH及7-AAD双染后FACS分选得到PKHhi (0.87±0.30%), PKHlow (39.2±11.58%)及PKHneg(58.2±8.32%)亚群细胞；克隆球形成实验证明PKHhi细胞具有极强克隆球形成实验,同时其能够被奥沙利铂富集,高表达干细胞基因及高裸鼠体内成瘤能力,我们证实了PKHhi细胞是一群同时具有低分裂增殖速度与干细胞特征的细胞亚群。2. PKHhi细胞是一群独特的肿瘤干细胞亚群。对PKHhi细胞进行了大肠癌CSC相关标记物的检测,结果显示相比于PKHlow与PKHneg细胞亚群(PKHlow CD133+,16.4±3.3%; CD44+/CD24+,27.8±7.2%; ALDH1+,3.7±1.4%; PKHneg CD133+,1.5±1.4%; CD44+/CD24+,4.7±1.1%; ALDHl+,0%),PKHhi细胞虽然高表达大肠癌干细胞标记(CD133+,57.5%±13.3%; CD44+/CD24+,71.6%±11.8%; ALDH1+,16.3%±2.1%),但这些传统大肠癌CSC表面标志物只表达于部分PKHhi细胞,反之亦然。说明QCCSC不能为传统大肠癌肿瘤干细胞标志物所替代。此外,Lgr5+细胞被认为是一群快速分裂的具有大肠癌CSC亚群,FCM检测显示PKHhi与Lgr5相互间几乎不存在共表达,同时连续时间点激光共聚焦显微镜观察发现,PKHhi细胞在进入增殖分裂后Lgr5表达逐渐增强,提示其两者可能存在谱系关系。3.IFN-γ选择性杀伤静息大肠癌肿瘤干细胞Annexin-V及7-AAD双染结果显示,IFN-γ能特异性抑制大肠癌细胞的克隆球形成,且呈剂量依赖性,提示IFN-γ对CCSC可能存在特异性杀伤作用。然后,我们分别检测了PKHhi, PKHlow及PKHneg对奥沙利铂及IFN-γ杀伤作用的敏感性,结果发现PKHhi细胞对奥沙利铂明显存在化疗抵抗,但相比PKHlow及PKHneg细胞,其对IFN-γ诱导的细胞凋亡更为敏感；而PKHlow及PKHneg恰恰相反,更容易被奥沙利铂杀伤而对IFN-γ不敏感。据此,我们通过体外实验比较IFN-γ与奥沙利铂不同时序组合杀伤PKHhi效应,发现IFN-y同时联合奥沙利铂可以同时杀伤PKHhi, PKHlow及PKHneg细胞,裸鼠移植瘤模型也证实IFN-γ联合奥沙利铂抑瘤效果最为明显。4.静息大肠癌干细胞特异性高表达IFN-y受体。根据上述实验结果,我们试图探索PKHhi对IFN-y高敏感性的原因。我们通过FCM分析发现,PKHhi细胞高表达IFN-γR1与IFN-γR2,而PKHlow及PKHneg细胞的表达量则较低。接下来我们通过蛋白质免疫印迹及激光共聚焦实验证明了在IFN-γ作用下,PKHhi细胞中IFN-y诱导的凋亡相关通路高度激活；对细胞IFN-yR进行抗体阻断后,IFN-y对PKHhi与其他细胞亚群的杀伤差异明显减弱。上述结果说明QCCSC特异性高表达IFN-yR从而导致了其对IFN-y诱导凋亡的高敏感性。5.静息大肠癌干细胞低表达miR-4666-3p.大量证据表明表观遗传学调控对CSC的增殖、分化等存在明显影响。因此在上述结论基础上,我们试图从microRNA的层面探索QCCSC与其他亚群细胞间存在IFN-γF滚达差异的原因或上游机制。我们应用miRNA芯片研究发现QCCSC与普通大肠癌肿瘤细胞间的miRNA表达谱具有明显差异,其中miR-4666-3p在PKHhi细胞中明显低表达,提示miR-4666-3p可能为抑癌基因。对miR-4666-3p靶基因进行KEGG信号通路聚类分析,发现其具有潜在抑制大肠癌CSC特征的可能性。同时我们通过生物信息学分析预测IFN-γRl/2为miR-4666-3p靶基因。我们证实IFN-γRl/2mRNA3’端非翻译区包含miR-4666-3p的保守结合位点,荧光素双报告基因系统检测示miR-4666-3p可引起miRNA靶基因报告载体荧光强度的明显改变。且大肠癌细胞中转染miR-4666-3p后,IFN-yRl/2表达均明显下调。6. miR-4666-3p抑制静息大肠癌肿瘤干细胞的自我更新,促进其分化。慢病毒感染成功建立miR-4666-3p大肠癌细胞高表达／抑制的稳定细胞系以验证其生物学功能。体外实验证实miR-4666-3p能明显抑制QCCSC的连续克隆球形成能力,增强奥沙利铂敏感性,同时使得干细胞相关基因(KLF4, OCT4, NANOG, SOX2)表达降低,上皮细胞分化标志E-caderin, Pan-karetin表达增加；裸鼠体内连续成瘤实验证实miR-4666-3p具有抑瘤作用。以上结果均表明miR-4666-3p具有抑癌作用,提示其可成为潜在的治疗靶点或抗癌药物。研究结论QCCSC是一个独立的肿瘤干细胞亚群,是肿瘤耐药、复发的根源。我们通过PKH细胞膜染色结合无血清克隆球培养分离出静息大肠癌细胞,通过一系列实验证明其具有相对静息及CSC的特性。同时还率先发现QCCSC高表达IFN-γR导致其可以被IFN-γ选择性杀伤。在其上游机制研究中,我们首次报道miR-4666-3p低表达于QCCSC (PKHhi细胞),且IFN-yRl/2均为其功能靶基因。此外,我们发现miR-4666-3p具有抑制QCCSC自我更新,促进其分化的作用。本研究不仅丰富了大肠癌干细胞调控机制理论,更为以后发展有效的肿瘤治疗药物提供了一个新的靶点和思路,为进一步药物二次开发打下基础。