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研究背景:糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）是2型糖尿病（Type 2diabetes mellitus,T2DM）患者最为常见的微血管并发症之一,会严重影响肾功能,继而发展为终末期肾脏病,影响患者生活质量和生命。随着病情的发展,DKD进展的最终结局是肾脏纤维化,病理上可表现为肾小球和肾小管基底膜弥漫性增厚、K-W结节形成、系膜基质增多、肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化以及炎细胞浸润等。肾小管间质占据了肾脏实质的绝大部分,过去认为DKD是一种与肾小球有关的疾病,但最近的研究表明,肾小管损伤和进行性间质纤维化与DKD的预后更密切相关。肾小管上皮细胞是肾脏固有细胞,在肾小管间质纤维化（Tubular interstitial fibrosis,TIF）发生发展过程中起重要作用。DKD时糖、脂代谢紊乱可以引起肾小管间质细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）生成增加,产生的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）损伤线粒体、引起细胞凋亡、上皮间充质转分化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）,进而导致TIF。吡啡尼酮（Pirfenidone,PFD）是一种可以口服的、具有抗纤维化作用的、小分子吡啶酮类化合物,临床上主要应用于治疗特发性肺纤维化,它同时具有抗炎、抗氧化损伤和抗凋亡的作用。有研究表明PFD可以减轻DKD肾脏纤维化水平,但具体机制缺乏实验证据。因此,本研究主要分析PFD对2型糖尿病时肾脏纤维化的改善情况及其相关机制。研究显示PFD可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路减轻肺纤维化。Wnt/β-catenin信号通路广泛参与糖尿病时的肾脏损伤过程,如ECM生成、细胞凋亡和肾小管上皮细胞发生EMT等。因此,我们推测,PFD可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路改善2型糖尿病时肾脏的细胞凋亡、EMT,进而起到抗肾脏纤维化的作用。研究目的:我们通过高脂饮食联合链脲霉素（Streptozocin,STZ）诱导的T2DM小鼠模型和高糖高脂作用的肾小管上皮细胞模型,探究吡啡尼酮对2型糖尿病肾脏的保护作用和具体作用机制。研究方法:1.证实PFD对2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用。体内实验,选取7周龄的雄性C57BL/6N小鼠随机分为4组,即:对照组（Ctrl）、吡啡尼酮组（PFD）、糖尿病组（DM）、糖尿病+吡啡尼酮组（DM+PFD）。3个月高脂饮食后,单次腹腔注射100mg/kg STZ,构建2型糖尿病小鼠模型。2型糖尿病模型建立后,分别给予小鼠空白溶剂或500mg/kg PFD每日1次灌胃处理。灌胃10周后处死小鼠并取材。处死前测量血糖、体重、收集小鼠血液和24h尿液标本,通过组织学染色（PAS染色、Masson染色和天狼星红染色）观察小鼠肾脏组织形态学的改变,通过蛋白印迹技术（Western blot）、TUNEL染色、免疫组化等评估肾脏纤维化、凋亡、EMT以及氧化损伤等指标。2.明确PFD对高糖高脂作用的肾小管上皮细胞的保护作用。体外实验,选取葡萄糖和棕榈酸钠处理肾小管上皮细胞,建立高糖联合高脂作用的细胞模型,应用适宜浓度的PFD进行干预。细胞实验分为4组:对照组（Ctrl）、吡啡尼酮组（PFD）、高糖高脂组（HG-P）、高糖高脂+吡啡尼酮组（HG-P+PFD）。应用Western blot、细胞免疫荧光等方法检测纤维化、细胞凋亡和EMT水平。3.探究PFD对2型糖尿病时肾脏和高糖高脂作用的肾小管上皮细胞保护作用的具体机制。体内实验,应用Western blot方法检测Wnt/β-catenin信号通路中的关键指标,应用免疫组化检测β-catenin的肾脏表达定位;体外实验,应用Western blot方法检测Wnt/β-catenin信号通路中的关键指标,应用细胞免疫荧光检测肾小管上皮细胞β-catenin的表达水平和定位。研究结果:1.PFD对T2DM小鼠一般指标的影响。动物实验中通过对小鼠生理、生化指标的检测发现,与对照组相比,糖尿病组小鼠体重减轻,肾脏肥大指数、血糖、尿白蛋白/尿肌酐水平、血尿素氮、血肌酐和血胆固醇水平明显升高;PFD治疗后,尿白蛋白/尿肌酐水平、血尿素氮和血肌酐水平下降,但体重、血糖、肾脏肥大指数和胆固醇水平与糖尿病组相比无明显差异。2.PFD对T2DM小鼠肾脏形态学的影响。通过对小鼠肾脏组织形态学的观察发现,与对照组相比,糖尿病小鼠肾脏病理表现为肾小球肥大、系膜基质增多、肾小管间质纤维化和肾小管线粒体损伤严重;PFD治疗后,上述病变减轻。3.PFD对T2DM小鼠肾脏纤维化、细胞凋亡、EMT和氧化损伤的影响。通过对小鼠肾脏纤维化、细胞凋亡、EMT和氧化损伤相关指标的检测发现:1)与对照组比较,糖尿病组小鼠肾脏纤维化指标CTGF、Fibronectin、Collagen VI和Collagen I蛋白表达水平升高;PFD治疗后,上述指标表达下降。2)与对照组比较,糖尿病组小鼠肾脏凋亡指标Caspase 3和Bax/Bcl-2蛋白表达水平升高,肾小球和肾小管中TUNEL染色阳性的细胞数均增多;PFD治疗后,Caspase 3和Bax/Bcl-2蛋白表达下降,TUNEL染色阳性的细胞减少。3)与对照组比较,糖尿病组小鼠肾脏上皮细胞标志物E-cadherin表达下降,间质细胞标志物α-SMA表达增多;PFD治疗后,E-cadherin表达升高,而α-SMA表达下降。4)与对照组比较,糖尿病组小鼠肾脏抗氧化酶SOD活力下降,氧化损伤相关指标Nrf2和NQO1蛋白表达升高;PFD治疗后,SOD活力、Nrf2和NQO1的表达水平较糖尿病组无明显差异。4.PFD对高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞纤维化、凋亡和EMT的影响。细胞实验通过对肾小管上皮细胞纤维化、凋亡和EMT相关指标的检测发现:1)与对照组相比,高糖高脂刺激的肾小管上皮纤维化指标CTGF和Fibronectin表达水平升高;给予PFD干预后,上述指标表达下降。2)与对照组相比,高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞凋亡指标Caspase 3和Bax/Bcl-2蛋白表达水平升高;给予PFD干预后,上述指标表达下降。3)细胞免疫荧光结果显示高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞α-SMA表达水平较对照组升高;而应用PFD干预后α-SMA表达水平下降。相反的,高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞E-cadherin表达较对照组减少;而PFD干预后,Ecadherin表达增多。5.PFD对T2DM小鼠肾脏和高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。1)动物实验显示,糖尿病组小鼠β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表达水平升高,PFD治疗后上述指标表达下降;免疫组化结果显示糖尿病小鼠肾脏中β-catenin表达增多,在肾小管上皮细胞中更明显,经过PFD治疗后β-catenin表达下降。2)细胞实验显示,高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞Wnt1、p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达增多,PFD干预后上述指标表达下降;细胞免疫荧光结果显示高糖高脂刺激的肾小管上皮细胞胞浆和细胞核中β-catenin表达均增多,PFD治疗后表达减少。结论:1.PFD可以降低2型糖尿病小鼠的尿蛋白/尿肌酐、血尿素氮和血肌酐水平,改善肾功能。2.PFD可以改善2型糖尿病小鼠肾脏病理形态变化。3.PFD可以降低2型糖尿病小鼠肾脏细胞凋亡和EMT水平,从而起到改善肾脏纤维化的作用,在抗氧化损伤方面作用有限。4.PFD可以降低高糖高脂干预的肾小管上皮细胞凋亡和EMT水平,减轻纤维化水平,保护肾小管上皮细胞。5.PFD对糖尿病时肾脏的保护作用是通过下调Wnt/β-catenin信号通路实现的。