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皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipases，CRLs)是工业生产中应用最为广泛的脂肪酶之一，其八种同工酶性质各异。在原始的C. rugosa菌株中，脂肪酶LIP1相对其他同工酶有更高的表达量，并且具有较高的水解、转酯和酯化活力。但原始菌株的表达量难以满足实际需要。利用基因工程技术实现其异源高效表达，对该酶的工业化生产具有重要意义。本文以皱褶假丝酵母菌株(ATCC1480)脂肪酶基因lip1为对象，为在毕赤酵母中表达有活性的CRLLIP1蛋白，将lip1脂肪酶基因中19个非通用丝氨酸密码子进行改造，并利用多种策略提高CRLLIP1的表达量，实现了异源高效表达。同时，优化重组菌株的摇瓶发酵条件，考察了重组脂肪酶CRLLIP1的酶学性质。本文的主要工作和结果如下：1.采用PCR-based accurate synthesis法合成lip1基因，并将其中19个编码丝氨酸的密码子CTG改造为TCT。以合成的基因为基础构建诱导分泌型表达载体pPIC9Klip1，电转入Pichia pastoris GS115菌株，筛选到一株酶活力最高的重组菌株GS115/9Klip1139~#，酶活为365U/mL。对该菌株单因子摇瓶发酵条件进行了优化，摇瓶发酵初始pH为7.5，接种量4.0%(v/v)，摇瓶装液量为40mL，每隔24h补加1.0%(v/v)的甲醇，诱导96h，测定的脂肪酶活力最高为435U/mL。同时，对重组CRLLIP1进行了酶学性质分析。结果表明，CRLLIP1的最适反应温度和pH分别为40°C和8.0，40°C温浴4h后，还保留有59%的酶活力，最适底物为对硝基苯酚癸酸酯(C10)，与原始菌株一致。2.构建表达载体pGAPlip1和pFZlip1；克隆含有编码VHb蛋白基因片段5’AOXVgb3’AOXTT，并成功构建重组表达载体pGAPvgb-lip1和pFZvgb-lip1。将pGAPlip1、pFZlip1、pGAPvgb-lip1和pFZvgb-lip1二次电转入GS115/9Klip1139~#，分别构建两种不同类型的双启动子重组菌株和两种启动子表达CRLLIP1且胞内共表达VHb的重组工程菌株。摇瓶发酵筛选得到GS115/9Klip1GAPlip120~#、GS115/9Klip1FZlip139~#、GS115/9Klip1GAPvgb-lip171~#和GS115/9Klip1FZvgb-lip11~#四株高产脂肪酶菌株，酶活力分别为437U/mL、450U/mL、512U/mL和620U/mL，分别是GS115/9Klip1139~#酶活力的1.19、1.23、1.40和1.69倍。3.以FM22盐培养基为发酵培养基，甲醇/山梨醇(1:1，v/v)混合物作为诱导期的碳源对GS115/9Klip1139~#、GS115/9Klip1GAPlip120~#、GS115/9Klip1FZlip139~#、GS115/9Klip1GAPvgb-lip171~#和GS115/9Klip1FZvgb-lip11~#五种重组菌株进行10-L发酵罐高密度发酵。其中，GS115/9Klip1FZvgb-lip11~#在130.7h时，酶活力达到7,490U/mL，总蛋白含量为4.80g/L，细胞湿重为413.3g/L。GS115/9Klip1GAPlip120~#(5,100U/mL)、 GS115/9Klip1FZlip139~#(4,100U/mL)、GS115/9Klip1GAPvgb-lip171~#(6,250U/mL)和GS115/9Klip1FZvgb-lip11~#发酵上清液酶活力分别是GS115/9Klip1139~#酶活力(2,820U/mL)的1.81、1.45、2.21和2.65倍。将重组工程菌株分泌的约64KDa蛋白在MALDT-TOP-TOP中检测得到的质谱结果与蛋白质结果在NCBI数据库中比对，鉴定重组工程菌株表达的蛋白为CRLLIP1。