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研究背景大肠癌是我国常见的发病率呈明显上升趋势的恶性肿瘤之一,居肿瘤死因的第4位,目前的五年生存率徘徊在50-60%左右,浸润转移等恶性生物学行为是治疗失败的原因。迄今对大肠癌浸润转移和复发机制尚待深入,阐明大肠癌浸润转移和复发机制是开展有效治疗的基础,对提高大肠癌患者的生存期限和生活质量有重要意义。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是指在特定的生理和病理情况下,具有极性的上皮细胞向具有移行能力的间充质细胞发生转化的现象。在EMT过程中,上皮细胞发生表型转化,最终成为成纤维细胞样的间质细胞表型,导致细胞极性消失、细胞间连接松散,同时细胞表型标志物发生改变,上皮表型如角蛋白丝、E-钙粘蛋白(E-cadherin)丧失,而获得波形蛋白(Vimemin)、纤维连接蛋白、N-钙粘蛋白等间质表型的表达。其中E-cadherin水平的下降可以导致细胞的粘附力降低,使细胞获得易于侵袭和转移的特性,E-cadherin表达的丢失已经被认为是EMT最显著的特征。近来EMT与肿瘤侵袭与转移相关的研究成为了研究热点。依据EMT的特定生生物学环境、功能的不同及其对机体的不同影响将其大致分为3种类型：Ⅰ型EMT与胚胎发生、器官发育相关,Ⅱ型EMT与创伤愈合、组织再生和器官纤维化相关,Ⅲ型EMT与肿瘤侵袭和转移相关,这型EMT发生于部分恶性肿瘤细胞中,肿瘤上皮细胞通过EMT获得了很强侵袭和转移能力,随血流转移至不同部位,进一步通过间质上皮转化(mesenchyal epithelial transition,MET)过程形成上皮细胞的肿瘤转移灶,目前在上皮来源的肿瘤中,如卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌等都可以监测到EMT过程,EMT在肿瘤的演进和转移中的作用是瞬时和可逆的,EMT过程受到了Snail, Slug, NF-KB, Twist等多种转录因子的调控。先锋转录因子FoxAl是一个转录因子FoxA家族中的一员,它通过和靶基因染色体序列的启动子或者增强子结合,诱导核小体结构重排使后续的转录因子能结合在染色质上从而促进靶基因的转录。FoxAl在生命体早期发育器官形成、成体的代谢和稳态维持、肿瘤的发展方面都具有重要作用。在乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的研究中发现FoxAl与肿瘤的侵袭和转移呈负相关并且能够调控肿瘤上皮细胞和间质细胞的转化,其在大肠癌浸润发展中的作用迄今尚未见报道。实验目的拟在先前研究的基础上,研究FoxAl在大肠癌组织中的表达情况,并通过基因表达谱芯片技术分析大肠癌细胞中FoxAl沉默后基因表达谱的变化,为研究FoxAl在大肠癌浸润转移中的作用机制和寻找新的生物学标记及靶向治疗药物提供基础。实验方法1.免疫组化二步法分析31例大肠癌临床样本中FoxAl的表达分布。2.通过将大肠癌细胞系SW620感染重组慢病毒的方法敲除FoxAl,并用有限稀释克隆法建立稳定沉默细胞系；通过瞬时转染技术在293T细胞中过表达FoxAl。3.用Western Blot的方法分别对比FoxAl沉默SW620细胞和正常表达的SW620细胞中EMT相关基因的表达和FoxAl过表达的293T细胞和正常293T细胞EMT相关基因的表达。4.提取FoxAl沉默的SW620细胞和正常表达的SW620细胞的mRNA逆转录成cDNA后做基因表达谱芯片分析。5.基因芯片的结果用DAVID软件和atBIONET软件进行GO分析、pathway分析和网络分析。实验结果1.FoxAl在31例大肠癌组织样本中都呈强阳性表达,其表达主要位于大肠癌上皮细胞内,间质细胞不表达FoxAl。其中部分大肠癌上皮细胞内FoxAl表达降低或缺失,可能与发生EMT有关。2.用Western blot的方法发现大肠癌细胞SW620细胞中FoxAl沉默后上皮表型标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调,间质表型标志波形蛋白(Vimentin)表达上调；293T细胞中过表达FoxAl后,EMT诱导转录因子Slug和Snail表达水平均下降,提示FoxAl沉默可以诱导EMT发生。3.经Human Genome U133Plus2.0Array基因表达谱芯片分析,FoxAl沉默组和对照组之间有1469个差异表达基因,其中666个基因FoxAl沉默后表达上调,803个基因表达下调。其中间质同源框蛋白2基因(MEOX2)相对上升了67.76倍,神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(SERPINI1)上升了33.05倍,核糖体蛋白S6基因(RPS6)下降了98.04倍,细胞因子样蛋白1基因(CYTL1)下降了77.13倍,白细胞活化粘附分子基因(ALCAM)下降了57.10倍。4.GO分析提示差异表达的基因的功能分类主要集中在细胞粘附、发育和结合等方面；Pathway分析显示差异基因参与的信号通路主要有肿瘤相关信号通路,黏着斑信号通路,胰岛素信号通路等；网络分析预测了差异表达基因中的潜在的分子标志物。结论1.部分大肠癌上皮细胞内FoxAl表达缺失可能与发生上皮间质转化有关。2.大肠癌细胞中FoxAl沉默后诱导了EMT发生。3.生物信息学分析表明FOXAl及其相互作用基因主要与细胞粘附、细胞固有膜组成、DNA结合等功能相关,差异基因主要参与了与癌症相关通路、粘附斑信号通路和细胞外基质受体信号通路,说明FOXAl诱导EMT发生可能是通过调节这群基因的表达变化来起作用。