背景前列腺癌已成为严重威胁老年男性健康的恶性肿瘤之一，在我国随着前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)的筛查普及和居民生活习惯的改变而导致其检出率不断增加。前列腺癌的早期诊断对于病人的预后具有重要意义，但是目前的影像学技术对早期前列腺癌的诊断存在灵敏度不高、特异性不强等问题。分子影像学的出现能够在病变发生解剖结构改变之前发现功能变化，对传统影像学是一种有效的补充。结合超声检查技术的方便快捷、实时性好和安全无辐射的特点，超声造影技术(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)能够提高前列腺癌的早期诊断。超声纳米泡是一种粒径小、稳定性好和穿透能力强的一种造影剂，能够利用肿瘤增强的渗透和滞留效应(enhanced permeability and retention effect, EPR)即基底膜不完整、肿瘤新生血管内皮间隙增宽和周围淋巴回流不畅的特性穿过肿瘤血管，实现肿瘤实质的显像。而前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)是一种相比于PSA更为特异的前列腺癌标记物，在细胞膜上表达的特性使其成为一种重要的靶点，广泛的应用于前列腺癌的靶向诊断和治疗研究中。前期我们课题组发现携带PSMA单克隆抗体的纳米泡在前列腺癌中能够实现靶向显像的目的，但是同时也发现，前期由于制备的靶向纳米泡粒径较大，可能在一定程度上影响纳米泡的穿透性能，因此我们寻求一种新的靶向PSMA的物质。而纳米抗体是首先发现在骆驼体内的缺失轻链和CH1区的重链抗体的可变区，具有极强的稳定性、分子量小和免疫原性低等众多特点。因此，我们期望构建携载PSMA纳米抗体的纳米泡，同时能够利用肿瘤的EPR效应实现前列腺癌的特异性超声分子显像，为前列腺癌的诊断、疗效监测及预后评价提供有效手段。目的在非免疫性纳米抗体噬菌体展示库中淘选得到特异性的PSMA纳米抗体，通过生物素-链霉亲和素方法将其与制备的生物素化纳米泡相连接构建靶向纳米泡；为进一步对比分析纳米泡和微米泡在穿透力方面的区别，我们通过数据分析和形态学观察证明在动物体内纳米泡能够通过肿瘤血管这一现象；在此基础上，研究靶向纳米泡与前列腺癌细胞特异性结合的能力，并探讨其在前列腺癌移植瘤中靶向显像的效果。方法1．在真核细胞中利用RT-PCR技术重组表达PSMA的胞外区；其后，利用固相淘选方法在非免疫的纳米抗体噬菌体库中经过四轮淘选得到与该重组蛋白特异性结合的噬菌体，随后在细胞水平采用细胞酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)以及细胞免疫荧光验证阳性噬菌体克隆的细胞特异性；在原核生物中重组表达该克隆携载的纳米抗体片段，进行生物素化修饰后，采用细胞ELISA与前期研究中使用的生物素化单克隆抗体进行亲和能力的比较。2．冷冻干燥法制备脂质纳米泡并检测其物理特性；使用超声诊断仪iu22上L12-5探头在体外琼脂糖模型和裸鼠胃癌移植瘤上研究纳米泡和微米泡(SonoVue○R)的成像效果，体内采用的具体造影指标包括起始显像时间、达峰时间、峰值强度和显像持续时间；通过心脏灌注的方法排除血管中脂质纳米泡的影响，利用超声爆破技术和组织冰冻切片技术从数据和形态学角度分别研究纳米泡在活体和离体的裸鼠胃癌移植瘤组织中的分布情况；使用透射电镜验证纳米泡在移植瘤中进入组织间隙的情况。3．蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测三种细胞(LNCaP、C4-2和MKN45)中PSMA的表达情况；利用生物素-链霉亲和素方法构建靶向纳米泡，并使用免疫荧光方法对其是否构建成功进行验证并与前期制备携载单克隆抗体的靶向纳米泡进行比较；在显微镜下观察纳米泡对细胞的靶向情况，以纳米泡个数/细胞和黏附率(靶向纳米泡数≥4个/细胞的细胞百分比)表示；采用超声造影技术观察靶向纳米泡在三种动物移植瘤(LNCaP、C4-2和MKN45)中的显影情况，统计分析四种超声造影指标包括起始显影时间、达峰时间、峰值强度和显影持续时间。结果1．测序结果表明编码PSMA膜外区的DNA片段序列正确，western blot表明该蛋白能够成功与其单克隆抗体进行结合；固相淘选方法从天然非免疫库中有效富集了噬菌体克隆，使其阳性率从第一轮淘选后的8.3%提高到第四轮淘选后的64.6%。细胞ELISA结果为PSMA表达阳性细胞LNCaP的OD450值为(0.62±0.04)，PSMA表达阴性的细胞MKN45的OD450值为(0.15±0.01)，两者具有显著的统计学差异(P<0.01)；免疫荧光亦表明得到的阳性噬菌体克隆能够与LNCaP细胞发生特异性结合，而不能与MKN45细胞发生结合。通过细胞ELISA检测生物素化纳米抗体与前期生物素化单克隆抗体对细胞的亲和力相当。2．制备的脂质纳米泡粒径为(435.20±60.53)nm；纳米泡在体外不同浓度的显影效果强于SonoVue○R，且具有明显的统计学差异；体内的四项造影指标：开始显像时间、达峰时间、峰值强度和显像持续时间均长于或者高于SonoVue○R的对应指标，具有明显的统计学差异(P值均小于0.01)；心脏灌注法排除血管中存留纳米泡的影响后，首次超声爆破与后续爆破产生的超声信号强度统计学分析表明80%(4/5)能检测出纳米泡的存在；冰冻切片技术表明纳米泡能够穿过肿瘤血管的内皮细胞间隙进入组织间隙，同时透射电镜亦证实纳米泡能够穿过新生的血管内皮间隙。3．Western blot实验表明，PSMA蛋白在LNCaP细胞中的表达量最高，C4-2细胞次之，MKN45细胞不表达。通过细胞ELISA发现原核生物表达的纳米抗体经生物素化修饰后，能够与PSMA表达阳性的LNCaP细胞发生特异性结合。通过生物素-链霉亲和素方法构建的靶向纳米泡的粒径为(487.60±33.55)nm，明显小于前期携载单克隆抗体的靶向纳米泡的粒径(644.30±55.85) nm，荧光免疫实验证明了该纳米泡能够携带生物素化的纳米抗体；细胞实验表明靶向纳米泡能够与LNCaP细胞、C4-2细胞发生结合，黏附率达90%以上，与MKN45细胞未发生明显结合；移植瘤体内的超声造影结果表明：在LNCaP和C4-2移植瘤中，靶向纳米泡的峰值强度和显影持续时间与空白纳米泡有明显差异(P<0.01)；与MKN45移植瘤相比，C4-2移植瘤4种指标均有差异(P<0.05)，而LNCaP移植瘤中的起始显影时间、峰值强度有明显差异(P<0.01)。结论1．成功制备了PSMA的胞外区蛋白，从非免疫纳米抗体噬菌体展示库中淘选得到了能与PSMA特异性结合的纳米抗体并进行了细胞水平的验证。同时，通过与前期生物素化的单克隆抗体比较证实了抗PSMA纳米抗体对前列腺癌细胞具有较好的亲和能力。2．脂质纳米泡的体内体外显影效果均优于微米泡SonoVue○R，且能够穿过肿瘤新生血管内皮间隙，为肿瘤血管外超声显像提供了形态学依据，亦为纳米泡在肿瘤血管外靶向超声诊断和超声辅助治疗中的应用提供了实验依据。3．构建的携载PSMA纳米抗体的靶向纳米泡，能够在体外特异性地与前列腺癌细胞结合，并在前列腺癌移植瘤中具有特征性的显影效果。该结论与前期的携载单克隆抗体的纳米泡结果一致，也是以峰值强度增强和显影持续时间延长为主要显像特征。同时本研究也为以携载纳米抗体的纳米级造影剂在肿瘤超声分子影像学中的应用提供了研究基础和方法。