生物体内的多种酶促反应需要焦磷酸硫胺素(ThDP)作为辅酶,由于这类酶促反应中的酶在发挥作用时必须依赖于ThDP,因此将这类酶称为ThDP依赖型酶。乙酰乳酸合酶(AHAS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)都属于ThDP依赖型酶。AHAS是支链氨基酸生物合成途径中第一步反应的限速酶,该酶存在于细菌,酵母及植物中,不存在于动物及人体中,因此AHAS成为筛选抗菌素、除草剂的靶标。DXS是2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)萜类化合物生物合成途径的第一个关键酶,该途径存在于细菌、疟原虫及植物的质体中,动物及人体中不存在,因此DXS也可以作为新型抗菌素、抗疟药物的筛选靶标。本实验以海栖热袍菌的全基因组DNA为模板,构建了两个表达质粒pET28a-TmAHAS、pET28a-TmDXS,分别导入E. coli Rosetta(DE3)中,诱导表达了TmAHAS、TmDXS两种融合蛋白。TmAHAS以部分可溶性形式表达,分离纯化后测定了酶的活性、稳态动力学参数、稳定性以及温度、pH、时间对活性的影响。结果表明,TmAHAS的Km pyruwate为19.11mM,比活力为13.4U/mg,最适反应温度、pH、时间分别为80℃,7.0,45 min。在50mM Phosphate buffer (pH 7.0,20%甘油)中,80℃C保存4个月后活性仍达80%。活性抑制实验表明,氯磺隆与氯嘧磺隆对TmAHAS的IC50分别为1.49 μM、88.8nM。此外,TmAHAS还可催化丙酮酸与苯甲醛反应生成L-苯基乙酰甲醇(L-PAC)这一医药工业中用于生产α/β-肾上腺素的重要前体物质。因此,TmAHAS不仅可以作为良好的抗菌药物的筛选靶标,还可用于手性药物的合成。而表达的重组蛋白TmDXS全以包涵体形式存在,经过变性复性处理,得到了可溶性的TmDXS且活性良好,可以用于抗菌素的筛选。综上所述,这两种ThDP依赖性酶都可以用于抗菌素的筛选,同时由于这两种酶具有耐高温(70-90℃)特性,它们在工业生产中还具有潜在的应用前景。