HSV-2 gC蛋白无血清悬浮高表达细胞系的建立及纯化鉴定

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:JJ415722591
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单纯疱疹病毒二型(Herpes simplex virus type two,HSV-2)主要通过性传播和垂直传播,可以引起生殖器疱疹、新生儿疱疹性脑膜炎等,严重的造成流产、死产。具有感染率高、隐性感染、潜伏感染等特点,可在人体长期存在。目前尚无有效药物能控制其发生和复发。接种疫苗是防止感染的有效措施,但是目前全球没有疫苗上市。HSV-2是α-疱疹病毒亚科单纯病毒属,由核心、皮层、衣壳和包膜4个部分组成。其中编码的包膜糖蛋白有gB、gC、gD、gE等至少11种,其中gB和gD分布最广,含量最多。用这两种蛋白配伍的疫苗已进入临床实验,但是效果不佳。gC蛋白含量也很丰富,而且与免疫逃逸有关,它近年来被认为是很有希望的候选疫苗蛋白。本研究选择gC2蛋白为研究对象,利用基因工程技术,构建稳定高表达gC2的细胞株,建立gC2蛋白的纯化工艺,为疫苗研发奠定基础。通过对gC2蛋白序列进行分析,选取gC2蛋白的胞外区,优化基因序列并化学合成,在基因的两端分别加入两个酶切位点EcoR I和Not I,以pMCE5质粒和pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建pMCE5-gC2重组质粒和pcDNA3.1(+)-gC2重组质粒。将pMCE5-gC2质粒瞬时转染CHO-DG44细胞中进行表达评估。再稳定转染CHO-DG44细胞,通过dot blot初次筛选,MTX加压筛选获得阳性孔,再有限稀释法获得单个细胞株,通过稳定性评估和fed-batch培养,确定最好的细胞株。将选定的细胞株进行扩大培养,收集上清,摸索纯化条件。选最佳纯化方法进行纯化,获得蛋白。对获得的蛋白通过BCA法测浓度,高效液相色谱(HPLC)测纯度,SDS-PAGE和western blot检测分析。双酶切pMCE5-gC2及pcDNA3.1(+)-gC2,和以pMCE5-gC2及pcDNA3.1(+)-gC2为模板PCR扩增,上述产物电泳检测均可见1400bp目的基因片段,与预计分子量相同,证明构建的pMCE5-gC2和pcDNA3.1(+)-gC2质粒含有目的基因。用重组质粒pMCE5-gC2瞬时转染CHO-DG44细胞,western blot检测,上清内表达70kDa左右目的蛋白带,证明gC2蛋白能分泌性表达。稳定表达细胞系的筛选,经过初筛,两轮MTX筛选后,再通过有限稀释法克隆化筛选,获得三株表达量高的克隆clone8,clone16,clone24,通过fed-batch培养和稳定性评估,clone24表达量最高,稳定性好。取clone24扩大培养,建立了表达蛋白的纯化工艺。比较了三种纯化条件:阳离子交换层析纯化(分别用缓冲液为25mM Tris-HCl,pH9.0和缓冲液为20mM PB,pH7.0);阴离子交换层析(缓冲液为25 mM Tris-HCl,pH 8.5)。结果显示,阴离子交换层析纯化效果最好。批量放大纯化了2批蛋白,分别获得90mg(纯度为98.4%)和30mg(纯度为96.8%)gC2蛋白。本研究成功构建了能稳定高表达HSV-2 gC蛋白的CHO-DG44细胞株,建立了纯化工艺,纯化获得了高纯度的gC2蛋白,为研制HSV亚单位疫苗和检测试剂奠定了基础。
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