血管紧张素1-7通过Mas受体减轻血管紧张素Ⅱ所致人肾小球内皮细胞损伤的实验研究

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目的本研究通过体外培养人肾小球内皮细胞(HGECs),筛选血管紧张素Ⅱ(Ang II)对HGECs合适的作用浓度与时间,探讨血管紧张素1-7(Ang1-7)对HGECs的作用及可能机制。方法1方法1.HGECs的培养:细胞在含15%胎牛血清的低糖DMEM中于培养箱(饱和湿度、37℃、5%CO2)中常规培养。每24h进行更换新的培养液一次。HGECs汇合度约70%-80%左右后,用0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化、传代。2实验分组:所有细胞组在实验前更换无血清培养基静止培养12h,根据不同的干预因素将细胞随机分为6组:对照组(control组,不加干预因素组)、血管紧张素Ⅱ组(只加入Ang II)、血管紧张素1-7组(只加Ang1-7)、血管紧张素Ⅱ+血管紧张Ang1-7组(Ang II+Ang1-7组,先用Ang1-7预处理30min,再加入Ang II干预)、血管紧张素Ⅱ+血管紧张Ang1-7+Mas受体阻断剂组(Ang II+Ang1-7+A779组,先加A779预处理15min后再加Ang1-7干预30min,最后加入Ang II处理)、Mas受体阻断剂组(A779组)。3利用CCK-8实验检测细胞的毒性与测定细胞活力,依据加药后不同的细胞活力来筛选药物Ang II、Ang1-7、A779的作用浓度,选择合适的作用浓度与时间。4采用流式细胞学技术比较各组HGECs的凋亡率;利用流式仪检测DCFH-DA荧光标记的各组细胞内总体活性氧簇(ROS)含量,荧光显微镜照相法拍摄各组细胞ROS;5利用微板法技术测定HGECs培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量;应用硝酸还原酶法,间接测定HGECs培养液中一氧化氮(NO)释放水平;通过酶联免疫吸附(ELISA)实验检测HGECs的培养液中白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子α(TNF-?),转化生长因子β1(TGF-?1),单核趋化蛋白-1(MCP-1),细胞间黏附分子-1(s ICAM-1),内皮素(ET-1)的含量。结果1通过CCK-8细胞增殖实验,其中以HGECs活力较对照组的细胞活力具有显著的统计学差异作为最适浓度,选取1?mol/L的Ang II作用24 h作为干预浓度及时间,而Ang1-7在Ang II的基础上、A779在Ang II+Ang1-7的存在下测定各浓度梯度细胞活力变化,其中以出现显著差异浓度组为最佳。分别选取Ang1-7为0.1?mol/L、A779为10?mol/L。2与对照组比较,Ang II(1?mol/L)组中的HGECs凋亡率、胞内ROS(平均荧光强度)增加(P<0.05),上清液中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1、s ICAM-1的含量增加(P<0.05);与Ang II(1.0?mol/L)组比较,Ang II+Ang1-7(1.0+0.1?mol/L)组的细胞凋亡率、ROS水平降低,IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、s ICAM-1的含量减少(P<0.05);与Ang II+Ang1-7(1+0.1?mol/L)组比较,A779(10?mol/L)的加入增加了细胞的凋亡率、胞内ROS的含量,IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、s ICAM-1含量增多(P<0.05)。3在Ang II(1?mol/L)的基础上比较,Ang1-7(10、1、0.1、0.01μmol/L)的加入呈剂量依赖性抑制了LDH漏出、ET-1分泌、促进NO的释放(P<0.05)。结论1.Ang II可使HGECs凋亡率增加、ROS生成增多、炎症因子表达增多。2.Ang1-7通过Mas受体可降低Ang II致HGECs的凋亡率、减少ROS生成和炎症因子表达;3.在Ang II的存在下,Ang1-7的加入呈浓度依赖性抑制Ang II所致HGECs的损伤作用,其中LDH的漏出和ET-1的分泌减少、NO释放增多,而其保护作用可被Ang1-7拮抗剂A779几乎完全取消。
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