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心肌缺血性疾病一直是威胁人类健康的主要疾病之一,缺血性心血管疾病,是世界范围内常见的死亡率和发病率较高的常见病。有关心肌缺血性损伤的病理机制及有效地预防和治疗冠心病、心绞痛等心肌缺血性疾病的药物研究是大家关注的重点研究课题之一。映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)系从映山红花中提取的有效部位,其主要成分为槲皮素、金丝桃苷及芦丁等黄酮类化合物,我们之前的研究表明映山红花总黄酮对大鼠和小鼠的心肌细胞缺氧性损伤有保护作用。然而,TFR的保护作用机制还不是很清楚,本研究的目的探讨TFR对心肌缺氧损伤保护作用的机制,重点研究TFR作用与Rho相关的卷曲螺旋激酶(Rho associated coiled coil-forming kinase,ROCK),钾离子通道及H2S的关系。实验目的:1.观察TFR对于心肌缺血、缺氧性损伤的保护作用;2.探讨TFR抗心肌缺血性损伤作用与ROCK的关系,尤其是H2S介导的ROCK抑制与其抗损伤作用的关系;3.TFR对心肌细胞钾离子通道的作用。实验方法:1.冠状动脉左前降支结扎致大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,大鼠冠状动脉左前降支结扎30min后,再灌注90min,测定心电图、血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(creatinine kinase,CK)活性的测定,观察不同组心肌梗塞面积的比率,并进行心肌组织苏木素-伊红(HE)染色观察病理学改变,使用western blot方法检测其心肌组织中ROCK1和ROCK2蛋白的表达。2.新生乳鼠心肌细胞缺氧再给氧模型,检测细胞活力,LDH活性和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,c Tn T)水平和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。使用Western blot检测ROCK1和ROCK2蛋白表达水平。3.皮下注射Iso致小鼠心肌缺血模型,在CSE基因敲除小鼠及野生型小鼠上Sc Iso20mg/kg以制备心肌缺血损伤模型。观察造模后1、2、5、15、20min各时间点的ECG,观察ST段的变化,测定LDH、CK-MB等生化指标,HE染色后检查小鼠心肌病理改变,使用Western blot检测心肌组织ROCK1,ROCK2和MLC1蛋白表达水平。4.大鼠心肌细胞膜片钳检测,心肌细胞上的钾离子通道的外向和内向电流均被记录。为减少细胞大小的误差,采用电流密度进行记录(p A/p F)。记录心肌细胞上使用TFR、Ba Cl2、Apamin或IBTX前后细胞膜上电流的变化。实验结果:1.冠状动脉左前降支结扎致大鼠心肌缺血再灌注损伤可致大鼠ECG的ST段明显抬高,再灌注30 min时尤为明显,TFR(40、80 mg/kg)能显著抑制缺血再灌注大鼠心电图中ST段的抬高,ROCK抑制剂Y27632也能抑制心肌缺血再灌注大鼠ECG的ST段的抬高。2.缺血再灌注大鼠血清中LDH活力和CK水平显著上升,20、40、80 mg/kg TFR或Y27632 1mg/kg也能显著抑制LDH和CK活性上升。3.TFR20、40、80mg/kg可显著减少I/R损伤引起心肌梗死面积百分比(IS/AAR),verapamil 1.6 mg/kg和Y27632 30 mg/kg同样减少IS/ARR。4.TFR 40、80 mg/kg导致心肌细胞病理学变化。5.I/R损伤引起ROCK1和ROCK2蛋白表达增高。TFR20、40和80 mg/kg及ROCK通路阻断剂Y27632 30mg/kg显著的抑制I/R诱导的心肌细胞ROCK1和ROCK2蛋白表达的升高。6.TFR在3.7-300 mg/L的浓度范围内,可明显抑制A/R引起的新生大鼠心肌细胞活力下降,减少LDH活力、c Tn T水平和MDA含量。7.A/R可明显增加大鼠的新生乳鼠心肌细胞的ROCK1和ROCK2蛋白表达水平,TFR 33.3、100和300 mg/L或者ROCK通路阻断剂Y27632 1μmol/L显著的抑制了ROCK1和ROCK2蛋白的表达。8.在大鼠的心肌细胞,加入选择性内向整流钾离子通道阻断剂Ba Cl2(100μM),明显抑制内向钾离子电流,结果显示心肌细胞的内向钾离子通道由内向整流钾离子通道所介导;300 mg/L的TFR明显增加内向钾离子电流,且能被Ba Cl2所阻断,表明TFR能激活心肌细胞的内向整流钾通道;300 mg/L的TFR明显增加外向钾离子电流,再加入Apamin(300 nmol/L)选择性SKca通道阻断剂,明显抑制外向钾离子电流,表明TFR能激活心肌细胞的SKca通道;加入BKca通道阻断剂IBTX(100nmol/L)后,对电流没有影响,说明心肌细胞上不存在BKca。9.CSE基因敲除小鼠在给Sc Iso后,其心电图ST段均有显著抬高,且抬高程度较野生型更为明显。KO小鼠TFR组和WT小鼠TFR组比较,抑制ST段的抬高的作用不明显。10.CSE基因敲除小鼠Sc Iso可致WT小鼠血清中LDH水平和CK-MB活性显著增高,且较野生型升高的更为明显。KO小鼠TFR组和WT小鼠TFR组比较,抑制LDH和CK-MB水平升高的作用不明显。11.TFR可明显改善WT小鼠心肌缺血引起的心肌细胞病理组织学改变,CSE KO小鼠正常组心肌细胞排列整齐,无变性坏死,无炎性细胞浸润。KO模型组心肌细胞结构发生了明显损伤,且损伤较野生型更为严重。12.WT小鼠Sc Iso导致的缺血后明显的增加ROCK1,ROCK2和MLC1蛋白表达水平。TFR 60 mg/kg显著的抑制了ROCK1,ROCK2和MLC1蛋白的表达。CSE基因敲除小鼠缺血后ROCK1,ROCK2和MLC1蛋白表达水平比野生型明显升高,但TFR对ROCK1,ROCK2和MLC1蛋白表达水平增高的抑制不明显。结论:1.TFR对于心肌缺血缺氧性损伤具有保护作用;2.H2S介导的ROCK通路的抑制参与了TFR抗心肌缺血缺氧性损伤作用;3.TFR促进心肌细胞的内向和外向钾离子通道的开放,特别是Kir通道和SKca通道,这可能也是TFR具有心肌保护作用的机制之一。