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研究目的:探讨使用慢病毒介导短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)沉默SFRP5(secreted frizzled-related proteins-5,SFRP5)基因对人类胆管癌RBE细胞株增殖、迁移以及细胞周期和细胞凋亡的影响。研究方法:对人胆管癌RBE细胞株进行体外培养,制备设计SFRP5干扰片段,使用慢病毒载体p LVX-sh RNA2构建慢病毒载体质粒,并进行基因测序鉴定,将构建好的慢病毒sh RNA载体以及辅助质粒共同转染293T细胞获得重组慢病毒,利用梯度测定法测定慢病毒滴度,使用Fu GENE?HD转染试剂将慢病毒转染入RBE细胞株,获得稳定转染的RBE细胞株,利用Western blot印迹法检测SFRP5-si RNA干扰组以及对照组的SFRP5蛋白表达水平变化,通过细胞免疫荧光染色检测SFRP5在RBE细胞中的表达情况,利用Real-time PCR检测SFRP5-si RNA干扰组以及对照组m RNA表达水平的变化,通过Transwell细胞迁移实验以及细胞划痕实验研究SFRP5沉默对胆管癌细胞的迁移能力的变化,使用CCK-8法检测SFRP5低表达对胆管癌细胞增殖水平的影响,利用流式细胞术检测SFRP5低表达对胆管癌细胞周期以及细胞凋亡的影响。实验结果:细胞免疫荧光结果显示RBE细胞株呈SFRP5阳性,故使用RBE细胞实行后续实验,将慢病毒RNA干扰慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进293T细胞后,在荧光倒置显微镜下可见转染成功的293T细胞表达绿色荧光,慢病毒浓缩后测得滴度为1×109 TU/ml,测序结果呈阳性;重组慢病毒成功转染RBE细胞,48h后通过荧光倒置显微镜可见绿色荧光,转染效率约达90%;Western blot结果显示,与对照组对比,SFRP5-si RNA干扰组组蛋白表达明显抑制,同时RT-PCR结果显示,SFRP5-si RNA干扰组细胞株SFRP5基因m RNA表达水平明显降低(p=0.0087),证实重组SFRP5慢病毒载体能够有效抑制RBE细胞m RNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测结果显示,与对照组对比,SFRP5-si RNA干扰组增殖活性明显增加(p<0.05);同时Transwell法检测结果显示,SFRP5-sh RNA-RBE组的穿膜细胞数约为[(310±15.63)个],较NC-sh RNA-RBE组的穿膜细胞数[(75±8.6)个]明显增加(p<0.05);同时细胞划痕实验结果显示划痕后的12h及24h时,SFRP5-si RNA干扰组细胞迁移率显著大于对照组(p<0.05);流式细胞术检测结果显示,SFRP5-si RNA干扰组细胞凋亡率(2.3%)明显低于对照组(12.3%),且处于G1期的SFRP5-si RNA干扰组细胞多于对照组(p<0.05)。结论:SFRP5可能在肝内胆管癌的发生发展中起到重要的调节作用,SFRP5低表达激活wnt信号通路,促进肿瘤的发生发展。通过上述实验结果,本文得出以下结论:人肝内胆管癌RBE细胞株中,沉默SFRP5基因表达可显著增强RBE细胞的增殖和迁移能力,SFRP5的沉默抑制细胞凋亡,SFRP5在胆管癌细胞RBE中起到抑癌作用。