黄缘盒龟(Curoa flavomarginata;又名Cistoclemmys flavomarginata)属偏陆生两栖动物,广泛分布于中国内陆离水源较近的湿润森林、山区丘陵以及丛林等地区,极少数也会栖息于水田,池塘和河谷中。黄缘盒龟不仅营养丰富且药用价值也较高,深受广大科研人员的关注。其肉、血、甲及心脏很早就被中国古代医师用作珍贵中药原料,如以龟板、龟壳为原料制成的断板龟注射液、断板片可用于治疗结核、痔瘘等病症,且对化疗引起的白细胞下降也有助升的作用。此外,黄缘盒龟还被中国民间用作防癌抗癌的药物,考虑其本身为复杂混合物,所以必然存在一种或多种具有较优抗癌性能的单体化合物。因此,借助分离纯化技术从黄缘盒龟中提取抗肿瘤活性物质具有很高的研究价值。具体研究结果如下:首先,采用水提法并结合均质、超声、微滤、超滤手段分别从黄缘盒龟的肌肉(龟肉)、血液(龟血)、甲壳(龟甲)中提取水溶性活性成分。3-(4,5-二甲基-2噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)实验结果表明,龟肉水提物分子量<10k Da的Cf-1组分体外抗肿瘤活性较优,且发现Cf-1可使人肝癌细胞Hep G-2脱壁和变圆变皱。小鼠肝癌H22肿瘤模型实验结果显示,在高剂量(300 mg/kg)给药情况下,Cf-1对肿瘤生长抑制率可达83.8%,表现出明显的抗肿瘤活性。此外,从小鼠各项指标测定的分析结果可以看出,相比于5-氟尿嘧啶(5-Fu)阳性对照组,给药Cf-1的小鼠肝脏重量无明显减少,且脾脏重量有所增加(P<0.05),该结果说明了给药Cf-1不会对小鼠造成明显的肝损伤,且有可能会增强小鼠的免疫力。在进一步的分离纯化实验中,采用MTT细胞毒性实验对抗癌组分进行跟踪。依次使用Sephadex G-25凝胶层析柱、DEAE纤维素DE-52层析和RP-HPLC从黄缘盒龟龟肉中分离纯化出抗肿瘤性能较优组分CFM-2。利用全波段紫外扫描和质谱分析,发现该物质主成分为多肽,且纯度较高,对应分子量测定结果为2989.6 k Da。N-末端氨基酸序列测定确定CFM-2对应的氨基酸序列为CRIGFGPIPFSLPEGLPKIPSVSTHIKV。MTT细胞毒性实验检测了CFM-2对肿瘤细胞系和良性细胞系活力的影响,实验结果表明CFM-2对人肝癌Hep G-2表现出明显的细胞毒性。但对人的成纤维细胞L929几乎没有抑制作用。且CFM-2对Hep G-2细胞在体外作用24小时后,对应的半数抑制浓度IC50=129.57±7.85μg/m L)。最后,对CFM-2的体外抗肿瘤作用进行了研究。利用细胞划痕和Transwell实验对CFM-2抑制癌细胞迁移能力进行确定,实验结果表明CFM-2能明显抑制Hep G-2细胞的横向和纵向迁移;采用流式细胞术检测CFM-2对癌细胞周期的阻滞作用,结果发现CFM-2可阻断Hep G-2细胞的G0/G1期而致使Hep G-2细胞增殖受到抑制;最后使用Annexin V/碘化丙啶染色法、DAPI染色法、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和流式细胞术对CFM-2诱发癌细胞凋亡的形态学进行评估,实验结果表明CFM-2可破坏Hep G-2细胞的细胞核、细胞器及细胞膜而诱发细胞凋亡。综上结果表明,CFM-2可应用于开发新型抗肿瘤药物。