沙门菌（Salmonella）是重要的人兽共患病病原,可通过食物链感染人,受污染的动物源食品是其重要来源,它们还可通过粪便进入到农田和水体中,通过果蔬进入食物链。我国的食源性疾病监测结果表明,17%左右的食品中毒事件由沙门菌导致,每年由沙门菌引起的食源性感染病例高达903.5万。铜、锌、锰重金属作为添加剂广泛用于预防动物疾病、促进动物生长及改善畜产品外观,由于铜、锌在养殖中大量使用,带来了沙门菌致病菌对其抗性。除此之外,抗生素被广泛用于预防和治疗致病菌引起的人和动物疾病,抗生素的广泛和不合理使用形成的筛选压力,会使沙门菌致病菌产生耐药性。为了降低传染的发生、阻止抗生素耐药菌的进一步危害,环境消毒控制成为控制致病菌传播的主要措施。然而,消毒剂使用的增多也会导致细菌对消毒剂的耐药性。重要的是,研究发现重金属、抗生素和消毒剂抗性基因常常共存于可移动遗传元件上（Mobile Genetic Elements,MGEs）可发生水平传播,并使菌株表现出对它们的共同抗性（Co-resistance）,这不仅增加了畜禽疾病控制的难度,也给耐药性防控带来了新的挑战。鉴于此,本研究拟以沙门菌为对象,在实验室保存菌株的基础上,继续分离鉴定沙门菌,测定沙门菌对重金属、抗生素和消毒剂的抗性表型,研究抗性特征以及它们之间的表型相关性;检测沙门菌重金属抗性基因型,研究沙门菌重金属抗性基因流行特征,以及与抗生素和消毒剂的抗性相关性;以抗铜沙门菌为对象,全基因组测序技术分析抗铜沙门菌株中抗性基因种类和基因环境特征;接合实验研究铜抗性基因的传播,体外竞争实验研究铜抗性菌株的适应性代价,利用qPCR测定在不同浓度铜压力下铜抗性、抗生素抗性基因的表达。通过以上研究,探明沙门菌对重金属抗性特征、以及与抗生素、消毒剂抗性相关性,探究沙门菌对铜抗性机制。主要研究及发现如下:（1）沙门菌对重金属抗性表型及与抗生素和消毒剂抗性相关性以来自四川省畜禽粪便、肉类食品、养殖场和人源粪便中的530株沙门菌为对象,测定沙门菌血清型以及对重金属、抗生素和消毒剂的抗性表型。研究发现沙门菌以 Typhimurium（61.9%,n=328）、Derby（8.7%,n=46）和 Enteritidis（8.5%,n=45）三种血清型为主。以质控菌株为标准对照,80.9%（n=429）的菌株对铜（Cu）表现出抗性,56.6%（n=300）的菌株对铬（Cr）表现出抗性,对锌（Zn）、锰（Mn）、镉（Cd）和钴（Co）的抗性分别达到 56.0%（n=281）、32.5%（n=172）、19.6%（n=104）和 5.3%（n=28）,其中 Typhimurium（n=328）对 Cu、Cr 及 Mn 的抗性率达到 96.6%（n=317）、97.3%（n=319）和 47%（n=156）,Derby（n=46）中 95.7%（n=44）、89.1%（n=41）、80.4%（n=37）及 69.6%（n=32）的菌株对Cd、Cu及Zn表现出抗性,Enteritidis（n=45）对Cd、Cu和Cr的抗性达到100%（n=45）、91.1%（n=41）和77.8%（n=35）。养殖场环境、肉源、动物粪便源和人粪便源沙门菌对铜均表现高的抗性,分别为89.0%、84.0%、65.0%和58.0%。Cu-Mn-Cr（25.1%,n=133）和 Cu-Zn-Mn-Cr（23.7%,n=126）是最主要的重金属抗性谱。药敏试验发现,沙门菌对消毒剂苯扎氯铵的耐药率为85.6%（n=443）,动物粪便源（90.7%）、肉源（88.6%）和养殖场环境（87.7%）沙门菌对苯扎氯铵的抗性显著高于人粪便源（29.0%）沙门菌。沙门菌对四环素、甲氧苄啶和阿莫西林/克拉维酸钾的耐药率达到78.1%、64.5%和30.7%,其中肉源、动物粪便源和人粪便源沙门菌耐药性显著高于其它抗生素,TET-TMP（17.9%,n=95）、TET（14.5%,n=77）和TET-TMP-CN（12.6%,n=67）是主要的抗生素耐药谱。相关性分析发现,沙门菌对重金属抗性均与至少两种以上抗生素抗性显著相关（P＜0.05）,对铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）和镉（Cd）的抗性与苯扎氯铵抗性显著相关（P＜0.05）。可见,沙门菌对重金属、抗生素和消毒剂抗性率高,沙门菌对它们抗性之间存在显著相关性。（2）沙门菌对重金属抗性基因型及与抗生素和消毒剂抗性相关性我们调查了沙门菌中重金属抗性基因的流行情况及与抗生素和消毒剂抗性性的相关性。结果表明,重金属抗性基因在沙门菌中普遍存在。97.9%（n=518）的菌株至少含有一种重金属抗性基因,介导对Cr、Zn、Cd产生抗性的czcD基因比例最高,占所有菌株的84.9%（n=450）,之后为介导对Cu抗性的pcoR、pcoC基因,分别占 58.8%（n=311）和 53.9%（n=285）,此外,菌株中携带nccA、cadD和merA 基因的比例分别为 43.7%（n=231）、40.6%（n=215）和 38.4%（n=203）。不同血清型分析发现,Typhimurium（n=328）和Derby（n=46）中抗性基因最高的都为czcD、pcoR和pcoC,其中 Typhimurium 中占比分别为 52.4%（n=172）、49.1%（n=161）和 48.5%（n=159）,而 Derby 中占比分别为67.4%（n=31）、50%（n=23）和 32.6%（n=15）,Enteritidis（n=45）中抗性基因最高的是pcoR,占的菌株比例为71.1%（n=32）、其次是pcoC和 czcD,分别为 64.4%（n=29）和 60.0%（n=27）。pcoR、ncrA和pbrA基因在动物粪便源菌株中的检出比例显著高于其它来源,merA和arsB基因在人源粪便菌株中的检出比例显著高于其它来源。共发现240种重金属抗性基因组合,其中 czcD（5.09%,n=27）、pcoC-czcD（2.45%,n=13）、czcD-pcoR（2.26%,n=12）为最高的三种组合。相关性分析表明,11种重金属抗性基因与至少两种抗生素的耐药性之间存在显著关联（P＜0.05）。肉源、养殖环境和人源粪便分离株中,pcoR、pcoC和pcoA基因与四环素、阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星、甲氧苄氨嘧啶和庆大霉素耐药性显著相关（P＜0.05）。所有沙门菌中pcoC、pcoA、cadD、pbrA、nccA、merA 和 基因与消毒剂（苯扎氯铵）耐药普遍相关。沙门菌中重金属抗性基因尤其是铜抗性普遍存在,且它们与对抗生素和消毒剂抗性之间存在显著相关性,可见,需要开展沙门菌对铜抗性机制,以及与其它抗菌药物耐药性相关性的研究。（3）抗铜沙门菌的全基因组特征及铜抗性基因环境分析根据表型和基因型的研究结果,选择了 9株铜抗性菌株（对铜的最小抑菌浓度≥800 mg/L）,进行二代全基因组测序,并在多个数据库（VFDB,CAZY,SWISSPROT,CARD,BacMet2,,KEGGet al）进行注释。菌株中均发现携带有毒力岛SPI-1和SPI-2,检出菌毛相关基因簇（fimA,I,C,D,F和H）。测序的菌株基因组中共检测到146个抗生素耐药基因,其中介导多重耐药的外排泵基因检出频率最高,占到42.5%。基因结构分析发现,主要有四种结构介导对铜的抗性:1)cus基因簇,除菌株S140A外,其它菌株中均发现cusS-pcoE基因结构;2)gol基因簇,基因结构为golBST;3)cueR-copA基因簇;4)pco-sil基因簇,包括pcoESRDCBAEG-silPGABFCRSE,pcoESRDCBAEG-silPAB-cusF-silCRS,以及 pcoC-pcoD,它们质粒介导传播。8 株沙门菌（S251、S152、S151A、S140A、S244、S142A、S54A和S246A）含有编码Cu/Ag抗性决定因子的pco/sil操纵子,其中4株菌株中位于整合结合转移元件（ICE）基因tral和traC之间,1株位于ars操纵子和tfc操纵子的中间,2株菌携带四环素耐药基因tet,以及汞操纵子mer。菌株S88A仅携带pcoC-pcoD基因簇。基于沙门菌携带基因种类以及基因结构环境,我们分析了不同抗性基因的作用,绘制了沙门菌对铜抗性的工作系统。（4）质粒介导的铜抗性基因的传播与表达我们对所选铜耐受菌株进行接合实验,并测定适应性代价,利用qPCR检测铜压力下pco基因和抗生素抗性基因的表达。研究发现,沙门菌的铜抗性pco基因可发生水平传播,菌株S251、S244的接合子表现出对铜的抗性,菌株S251中铜抗性基因位于含SGI-4的质粒上,在接合子和受体菌株之间没有显著的生长速率差异,接合子未表现出适应性代价。以菌株S251为对象,在不同浓度铜压力下诱导菌株,结果发现:在0.25×MIC铜压力下,菌株S251中铜抗性基因pcoR在2小时开始启动表达,4小时后达到最高,pcoA、pcoC在4小时后略有提高;外排泵基因mdtH、acrD则在30分钟左右即启动表达,mdtH表达在4小时后达到最高;氨基糖苷类抗性基因aph（6）-id、磺胺类抗性基因sul2在4小时表达也显著上调。在0.5×MIC铜压力下,菌株S251中pcoR、pcoC和pcoA基因在半小时左右启动表达,4小时后表达显著上调,外排泵基因在4小时后达到最高,四环素外排抗性基因tet（D）则是在2小时后表达显著上调;氨基糖苷类抗性基因aph（6）-id、磺胺类抗性基因sul2在4小时表达也显著上调。以上研究可见,pcoR、pcoC和pcoAet al铜抗性基因可由质粒介导传播,在铜亚抑制浓度压力下,沙门菌不但表现对铜的抗性,也会诱导抗生素抗性基因、外排抗性基因表达,从而使菌株表现出对其它抗菌药物的协同抗性。综上,重金属抗性沙门菌在畜禽养殖、肉类食品和养殖场环境中广泛流行,它们携带多种抗性基因,与环境选择压力、质粒可移动遗传元件传播有关,在禁抗减抗的背景下,由于铜重金属的在养殖中的大量使用,可引起菌株对其抗性甚至其它抗菌药物的共同抗性,并可在动物生产环境和食物链中存在和传播。本研究探究了沙门菌对重金属抗性特征,探讨了沙门菌对铜抗性的机制,可为防控致病菌与抗性传播提供科学依据,为重金属及抗生素和消毒剂的科学使用提供支撑。