目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是中老年常见的中枢神经系统变性疾病,主要临床表现为运动弛缓、震颤、强直、姿势平衡障碍等运动症状,此外,常伴发焦虑、抑郁、睡眠障碍、便秘、认知功能减退等非运动症状,其中,焦虑对PD患者的病情发展、生活质量、预后都有很大的影响,但是到目前为止对有引起焦虑事件预刺激的PD患者,各方面的改变了解甚少。因此,本实验采用C57BL/6J小鼠建立四种实验分组:空白对照组、焦虑预处理模型、急性PD模型、焦虑预处理的急性PD模型,旨在探讨焦虑预处理对急性PD小鼠模型情绪、运动功能、学习记忆功能以及黑质-纹状体多巴胺能神经元的影响。方法:将68只13周龄23~30g C57BL/6J健康雄性小鼠随机分为以下4组(n=17):(1)正常组(CON组):正常健康小鼠,不做任何处理;(2)焦虑预处理组(ANX组):采用改良Vogel饮水冲突法结合束缚方法预处理的小鼠模型;(3)急性PD模型组(PD组):采用腹腔注射MPTP制造急性PD模型;(4)焦虑预处理的急性PD模型组(ANX+PD组):在焦虑预处理后第3天给予小鼠MPTP药物,用于制造先有焦虑情绪后患PD的小鼠模型。各组小鼠在相同环境下饲养,焦虑预处理后第5,6,7和8-13天依次分别行旷场实验,高架十字迷宫实验,爬杆试验,水迷宫实验检测小鼠行为学改变,焦虑预处理后第14天取各组小鼠大脑,采用免疫组织化学观察黑质-纹状体酪氨酸羟化酶阳性(tyrosine hydroxylase positive,TH+)神经元的改变。结果:1焦虑预处理对小鼠的影响1.1焦虑预处理对小鼠情绪的影响焦虑预处理后第2天行高架十字迷宫实验,结果显示:与CON组比较,ANX组开臂进入次数占总进臂次数百分比(OE%)和开臂滞留时间占总进臂时间百分比(OT%)均显著减少(P<0.05)。表明小鼠存在焦虑情绪,焦虑预处理成功。焦虑预处理后第5天行矿场实验,结果显示:与CON组比较,ANX组路程百分比、时间百分比、穿格次数百分比和总穿格次数均有一定程度的减少,但差异均无统计学意义(P>0.05)。表明小鼠无焦虑、抑郁情绪。焦虑造模后第6天再次行高架十字迷宫实验,结果显示:与CON组比较,ANX组OE%、OT%差异均无统计学意义(P>0.05)。1.2焦虑预处理对小鼠运动功能的影响焦虑预处理后第7天行爬杆实验,结果显示:与CON组比较,ANX组爬杆时间差异无统计学意义(P>0.05)。1.3焦虑预处理对小鼠学习、记忆能力的影响焦虑预处理后第8-13天行水迷宫实验,结果显示:在定向航行实验阶段,各组小鼠定向航行5 d的寻台潜伏期逐渐缩短。与CON组比较,ANX组寻台潜伏期显著缩短(P<0.05)。在空间搜索实验阶段,与CON组比较,ANX组小鼠运动路程、滞留时间、穿台次数差异均无统计学意义(P>0.05)。1.4焦虑预处理对小鼠黑质-纹状体TH+神经元的影响1.4.1黑质TH+神经元的改变焦虑预处理后第14天行TH免疫组织化学染色,结果显示:ANX组与CON组小鼠黑质TH+神经元形态一致,神经元排列致密、整齐,胞核饱满,核仁清晰,平均每200倍视野阳性神经元数差异无统计学意义(P>0.05)。1.4.2纹状体TH+神经元平均光密度(Mean Optical Density,MOD)的改变与CON组比较,ANX组纹状体TH+神经元的MOD显著减少(P<0.05)。2 MPTP制造急性PD模型对小鼠的影响2.1 MPTP制造急性PD模型对小鼠情绪的影响MPTP注射前1天行高架十字迷宫,结果显示:与CON组比较,PD组OE%和OT%差异无统计学意义(P>0.05)。与ANX组比较,PD组OE%和OT%均显著增多(P<0.05)。MPTP注射后第3天行矿场实验,结果显示:与CON组和ANX组比较,PD组路程百分比、时间百分比、穿格次数百分比和总穿格次数差异均无统计学意义(P>0.05)。注射MPTP后第4天行高架十字迷宫,实验结果:与CON组和ANX组比较,PD组OE%和OT%的差异均无统计学意义(P>0.05)。2.2 MPTP制造急性PD模型对小鼠运动功能的影响MPTP注射后数分钟内小鼠出现震颤、弓背、竖尾、竖毛、后肢张开、步态不稳,呼吸急促,且随着给药次数的增加,其行为学出现时间越来越快,越来越明显。这些症状常在半小时内缓解,在24小时内基本恢复。MPTP注射后第5天行爬杆实验,结果显示:与CON组和ANX组比较,PD组小鼠爬杆时间差异无统计学意义(P>0.05)。2.3 MPTP制造急性PD模型对小鼠学习、记忆能力的影响MPTP注射后第6-11天行水迷宫实验,结果显示:与CON组和ANX组比较,PD组在定向航行实验阶段的寻台潜伏期显著延长(P<0.05),且在空间搜索实验阶段的运动路程、滞留时间、穿台次数均显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.4 MPTP制造急性PD模型对小鼠黑质-纹状体TH+神经元的影响2.4.1黑质TH+神经元的改变MPTP注射后第12天行TH免疫组织化学染色,结果显示:PD组小鼠黑质残留TH+神经元皱缩,不饱满,梭形改变,突起减少。与CON组和ANX组比较,PD组平均每200倍视野TH+神经元数较CON组下降49.70%,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4.2纹状体TH+神经元MOD的改变与CON组和ANX组比较,PD组纹状体TH+神经元的MOD降至CON组水平的69.90%,差异有统计学意义(P<0.05)。3焦虑预处理对急性PD小鼠模型的影响3.1焦虑预处理对急性PD小鼠模型情绪的影响焦虑预处理后第2天行高架十字迷宫实验,结果显示:与CON组和PD组比较,ANX+PD组OE%和OT%均显著减少(P<0.05)。与ANX组比较,ANX+PD组OE%和OT%差异均无统计学意义(P>0.05)。表明ANX+PD组小鼠同ANX组小鼠一样,均存在明显的焦虑情绪,焦虑预处理成功。焦虑预处理后第5天行矿场实验,结果显示:与CON组、ANX组和PD组比较,ANX+PD组路程百分比、时间百分比、穿格次数百分比和总穿格次数差异均无统计学意义(P>0.05)。焦虑造模后第6天再次行高架十字迷宫实验,结果显示:与CON组、ANX组和PD组比较,ANX+PD组OE%和OT%差异均无统计学意义(P>0.05)。3.2焦虑预处理对急性PD小鼠模型运动功能的影响焦虑预处理后第7天行爬杆实验,结果显示:与CON组、ANX组和PD组比较,ANX+PD组爬杆时间均显著增加(P<0.05)。3.3焦虑预处理对急性PD小鼠模型学习、记忆能力的影响焦虑预处理后第8-13天行水迷宫实验,结果显示:在定向航行实验阶段,与CON组和ANX组比较,ANX+PD组寻台潜伏期显著延长(P<0.05)。与PD组比较,ANX+PD组寻台潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。在空间搜索实验阶段,与CON组和ANX组比较,ANX+PD组运动路程、滞留时间、穿台次数均显著减少(P<0.05)。与PD组比较,ANX+PD组运动路程、滞留时间、穿台次数差异均无统计学意义(P>0.05)。3.4焦虑预处理对急性PD小鼠模型黑质-纹状体TH+神经元的影响3.4.1黑质TH+神经元的改变焦虑预处理后第14天行TH免疫组织化学染色,结果显示:ANX+PD组小鼠黑质残留TH+神经元皱缩,不饱满,梭形改变,突起减少,平均每200倍视野阳性神经元数较CON组下降49.40%。与CON组和ANX组比较,ANX+PD组黑质TH+神经元数均显著减少(P<0.05)。与PD组比较,ANX+PD组黑质TH+神经元数差异无统计学意义(P>0.05)。3.4.2纹状体TH+神经元MOD的改变与CON组和ANX组比较,ANX+PD组纹状体TH+神经元的MOD降至CON组水平的69.42%,差异有统计学意义(P<0.05)。与PD组比较,ANX+PD组纹状体TH+神经元的MOD有一定程度下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1焦虑预处理可使小鼠产生明显的焦虑情绪,但维持时间较短;可提高小鼠学习能力,损伤纹状体多巴胺能神经纤维,但对小鼠运动功能、记忆能力以及黑质多巴胺神经元无明显影响。2 MPTP制造急性PD小鼠模型,小鼠运动功能在给药半小时内明显损伤,但随着时间推移逐渐恢复,24h内基本恢复正常;显著降低小鼠学习、记忆能力;严重损害黑质-纹状体多巴胺能神经元和神经纤维;但不引起小鼠焦虑、抑郁情绪。3焦虑预处理明显加重急性PD小鼠模型运动功能损害,但对急性PD小鼠模型情绪、学习记忆能力以及黑质-纹状体多巴胺神经元和神经纤维无明显影响。