目的:目前人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）体外成脂分化主要在二维培养系统里进行,但在该培养条件下hBM-MSCs成脂分化的效果仍未达到理想状态。本研究旨在探讨锌和海藻酸钠水凝胶三维培养对hBM-MSCs体外增殖和成脂分化的影响,优化hBM-MSCs体外成脂分化的培养系统。方法:（1）采用密度梯度离心法分离hBM-MSCs,用含10%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM完全培养基培养细胞,每3天换液。取第3代细胞,胰酶消化后以2×10⁴/cm²接种于96孔细胞培养板培养,每天用CCK-8法检测450nm吸光度值并绘制细胞增殖曲线,确定细胞增殖速度最快的时间点。（2）取第3代hBM-MSCs,胰酶消化后以2×10⁴/cm²接种于96孔细胞培养板培养。对照组向细胞中加入完全培养基,锌处理组向完全培养基中加入硫酸锌,使锌终浓度分别为0.001、0.004、0.016、0.064和0.256mmol/L,培养至细胞增殖速度最快的时间点,用CCK-8法检测450nm吸光度值,比较细胞活性以确定适宜hBM-MSCs培养的锌浓度。（3）取第3代hBM-MSCs,胰酶消化后以2×10⁴/cm²接种于24孔板,用完全培养基培养,每3天换液。细胞融合至接触抑制后继续培养3天。加入成脂诱导培养基开始诱导成脂分化,诱导培养基里加入硫酸锌使锌终浓度分别为适宜hBM-MSCs培养的浓度。诱导21天后油红O染色,观察拍照,检测492nm吸光度值,比较不同锌浓度对hBM-MSCs成脂分化的影响。（4）收集各组诱导分化的脂肪细胞提取RNA,用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测相关成脂基因（PPARγ、C/EBPα和FABP4）的表达水平,比较不同锌浓度对hBM-MSCs成脂分化过程中成脂基因表达的影响。（5）取第3代hBM-MSCs,胰酶消化后用1.5%海藻酸钠水凝胶溶液重悬细胞,调整细胞密度为5×10⁶/ml,将细胞悬液滴入0.1mol/L氯化钙溶（CaCl₂）液制备海藻酸钠水凝胶小球,将小球置于24孔细胞培养板中培养,每3天换液。将同一细胞以2×10⁴/cm²接种于24孔细胞培养板中培养作为普通二维（2D）培养的对照组。用普通光学显微镜观察二维和三维培养的细胞形态和增殖状况,并用CCK-8法检测细胞增殖速度。（6）取第3代hBM-MSCs,胰酶消化后用1.5%海藻酸钠水凝胶溶液重悬细胞,调整细胞密度为5×10⁶/ml,将细胞悬液滴入0.1mol/L氯化钙（CaCl₂）溶液制备海藻酸钠水凝胶小球,将小球置于24孔细胞培养板中培养,每3天换液。将同一细胞以2×10⁴/cm²接种于24孔细胞培养板中培养作为普通二维（2D）培养的对照组。在二维培养的细胞融合至接触抑制后继续培养3天,然后在二维和三维培养中同时加入成脂诱导培养基开始诱导成脂分化。诱导21天后油红O染色,用普通光学显微镜观察细胞成脂分化的形态和效果,并检测492nm吸光度值,比较二维和三维培养对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响。结果:（1）hBM-MSCs接种后第1天处于贴壁过程中,生长相对停滞。从第2天起细胞增殖速度开始缓慢增长,处于生长潜伏期。从第5天起细胞增殖速度明显加快,细胞倍增时间明显缩短,至第6天细胞增殖速度达到高峰,处于指数生长期。从第7天起细胞增殖速度又开始减慢,逐渐达到平台期。（2）锌浓度为0.001和0.064mmo/L时,细胞活性与对照组无显著差别（P>0.05）;锌浓度为0.004和0.016mmo/L时,细胞活性增高（P<0.05）,以0.016mmo/L最为明显,显著高于对照组（P<0.001）,对细胞增殖有促进作用;锌浓度达到0.256mmo/L时,细胞活性与对照组相比明显降低（P<0.01）,对细胞生长具有抑制作用。结果表明锌对hBM-MSCs活性的影响呈量效关系,在一定浓度范围内,锌可明显促进hBM-MSCs的增殖。（3）锌浓度分别为0.001、0.004、0.016和0.064mmo/L的4组hBM-MSCs的成脂分化都显著强于对照组（P<0.001）。结果表明在一定浓度范围内,锌能促进hBM-MSCs成脂分化,作用呈浓度依赖性,以0.064mmo/L最为显著。（4）锌浓度分别为0.001、0.004、0.016和0.064mmo/L的4组hBM-MSCs相关成脂基因（PPARγ、C/EBPα和FABP4）的表达水平都显著高于对照组（P<0.001）。结果表明在一定浓度范围内,锌能显著促进hBM-MSCs相关成脂基因的表达,作用呈浓度依赖性,以0.064mmo/L最为显著。（5）hBM-MSCs包裹在海藻酸钠水凝胶小球里均匀分布,呈圆球形,能良好地生长。海藻酸钠水凝胶小球悬浮在培养基中,在三维培养期间一直保持着三维结构。在二维培养中hBM-MSCs接种1天后开始贴壁生长,呈梭形或多角形,在接下来的培养过程中细胞向四周扩散,呈放射状或漩涡状排列生长。（6）在各时间点（第1、3、5、7天）二维培养细胞的增殖速度都显著快于三维培养细胞（P<0.001）,在第7天二维培养细胞的增殖速度约为三维培养细胞的3.8倍。结果表明hBM-MSCs在二维培养中增殖更活跃。（7）在海藻酸钠水凝胶小球中hBM-MSCs可诱导分化为脂肪细胞,普通光学显微镜观察显示三维培养中分化的脂肪细胞呈圆球形,细胞质内充满圆形的小脂滴,形态与体内圆球形的脂肪细胞相似;而在二维培养中,hBM-MSCs成脂分化后仍贴壁生长,呈长梭形、长椭圆形或长多边形,细胞质内充满圆形的小脂滴。成脂诱导21天后,在二维培养中约40-50%的细胞分化为脂肪细胞,而在维海藻酸钠水凝胶小球中约80-90%的细胞分化为脂肪细胞。油红O染色检测492nm吸光度值的结果也显示在三维培养中hBM-MSCs的成脂分化效率显著高于二维培养（P<0.001）,约为后者的2倍。这些结果表明海藻酸钠水凝胶三维培养能显著提高hBM-MSCs的成脂分化效率。结论:（1）锌对hBM-MSCs活性的影响呈量效关系,在一定浓度范围内,锌可显著促进细胞的增殖。（2）锌可作为hBM-MSCs成脂诱导培养基的成分,显著促进细胞的成脂分化。（3）hBM-MSCs在海藻酸钠水凝胶小球中呈圆球形均匀分布,能较好地生长,但在培养早期其增殖速度比在二维培养中慢。（4）海藻酸钠水凝胶小球是良好的hBM-MSCs体外成脂分化三维培养系统,能显著提高细胞的成脂分化效率。