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鸭圆环病毒(Duck circovirus,Du CV)是单链环状无囊膜DNA病毒,属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员。研究表明Du CV感染主要引起鸭法氏囊淋巴细胞减少、萎缩、组织细胞增生等,我们前期进行的原位荧光检测也表明Du CV感染鸭后在鸭的脾脏、胸腺和法氏囊中形成明显的病灶,提示Du CV的致病作用可能与引起淋巴细胞的凋亡有关,这与PCV2的致病机理极为相似。前期我们验证了Du CV的Cap蛋白具有核定位信号,但其Rep蛋白是否具有核定位信号尚无定论,对于两种基因型Rep蛋白的促细胞凋亡活性研究尚无人涉及。前期研究我们发现并证明了ORF3蛋白是具有凋亡活性的蛋白,但两种基因型的ORF3蛋白促细胞凋亡活性是否存在差异尚需要试验证实。本研究主要进行了如下工作:1.Du CV Rep蛋白核定位信号的研究本研究通过c NLS Mapper软件(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)在线分析发现Rep1具有两个非典型的核定位信号,NLS1位于N端“10KRWVFTINNPTFEDYVHVLEFCTLDNCK37”,NLS2位于C端244ITSNKEPRDWYKSEFDLSALYRRINKYLVYN274,而在Rep2中只预测到了核定位信号NLS1。根据软件分析的结果,分别构建了与RFP融合表达的野生型Rep1和Rep2表达质粒(Rep1-Ds Red2、Rep2-Ds Red2)、NLS1缺失型表达质粒(Rep1?N10-37-Ds Red2、Rep2?N10-37-Ds Red2)、NLS2缺失型表达质粒(Rep1?N244-274-Ds Red2、Rep2?N244-274-Ds Red2)、NLS1和NLS2双缺失表达质粒(Rep1?N10-37?N244-274-Ds Red2、Rep1?N10-37?N244-274-Ds Red2)。转染H1299细胞48h后,通过在激光共聚焦显微镜下观察发现,C端NLS2的缺失没有改变Rep1和Rep2的核定位能力,而NLS1缺失后,Rep1和Rep2分布于胞浆中,失去了胞核转位的能力,从而证实了N端核定位信号是Rep进入细胞核所必须的。2.Du CV Rep蛋白促细胞凋亡活性的研究本研究通过构建两组表达质粒,分别是带flag标签的两种基因型Rep蛋白的表达质粒(p3×Flag-Du CV1-Rep、p3×Flag-Du CV2-Rep)和带EGFP标签的表达质粒(p EGFP-Du CV1-Rep、p EGFP-Du CV2-Rep),分别使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒、PE Annexin V凋亡检测试剂盒和APO-DIRECT检测试剂盒三种方法检测Rep的凋亡活性。因为没有合适的鸭源细胞系,考虑Du CV Rep蛋白在异源细胞系中的凋亡活性差异,分别在哺乳动物细胞系CHO和禽源细胞系DF-1上进行了Rep的凋亡活性分析。在凋亡检测过程中,分别采取了只收取贴壁细胞、同时收取贴壁和上清细胞的两种样品获取方式,在转染后24h、48h和72h三个时间点对样品进行了Rep凋亡活性的多重方法交叉分析。研究结果表明,Du CV两种基因型的Rep蛋白均存在一定的促细胞凋亡活性。在两种不同来源的细胞系中,使用两种不同的检测方法和两种不同收获细胞样品方式检测,均显示Rep1蛋白与对照组相比具有极显著的促细胞凋亡活性;而Rep2蛋白与Rep1蛋白相比,促细胞凋亡活性要弱很多,并且在哺乳动物来源细胞系上导致细胞凋亡的效应相对滞后,显示其蛋白凋亡活性可能比较温和。研究中还发现,禽源的DF-1细胞系对Rep2蛋白更敏感,更容易检测到其具有的凋亡活性。3.Du CV两种基因型ORF3蛋白的凋亡活性差异检测本研究通过构建两组表达质粒,分别是带flag标签的两个基因型ORF蛋白的表达质粒(p3×Flag-Du CV1-ORF3、p3×Flag-Du CV2-ORF3)和带EGFP标签的表达质粒(p EGFP-Du CV1-ORF3、p EGFP-Du CV2-ORF3),分别使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒、PE Annexin V凋亡检测试剂盒和APO-DIRECT检测试剂盒三种检测方法,在哺乳动物细胞系CHO和禽源细胞系DF-1上进行了Du CV两种基因型ORF3的凋亡活性分析。在凋亡检测过程中,分别采取了只收取贴壁细胞、同时收取贴壁和上清细胞的两种样品获取方式,在转染后24h、48h和72h三个时间点对样品进行了ORF3凋亡活性的多重方法交叉分析。研究结果表明,Du CV两种基因型ORF3蛋白均存在一定的促细胞凋亡活性,其中2型ORF3蛋白在转染早期表现较为明显的促细胞凋亡活性,并且随着时间的推移呈现先上升后下降的趋势;而1型ORF3蛋白发挥促细胞凋亡活性相对滞后,表现为随着时间的推移逐渐上升的趋势,并在转染后期其细胞凋亡活性显著高于2型ORF3。与禽源的细胞系DF-1相比,在哺乳动物细胞系CHO中,ORF3蛋白的促细胞凋亡活性发挥延迟,说明Du CV ORF3蛋白对不同的细胞系呈现不同的促细胞凋亡特点。4.Du CV两种基因型ORF3蛋白和Rep蛋白致Caspase活性差异研究Caspase的活化是凋亡的典型特征。本研究建立了检测细胞凋亡相关基因(caspase3、caspase8和caspase9)m RNA的荧光定量RT-PCR方法。分别将表达Du CV两种基因型ORF3蛋白的真核表达质粒转染CHO细胞,在转染后不同时间(24h、48h和72h)进行荧光定量PCR检测,结果表明,两种基因型Du CV ORF3蛋白转染后会在不同时间引起细胞中caspase3和caspase8 m RNA表达水平的上调,但与对照组差异不显著。分别将表达Du CV两种基因型Rep蛋白和ORF3蛋白的真核表达质粒转染CHO细胞,在转染后不同时间(24h、48h和72h)使用caspase酶活性检测试剂盒进行三种凋亡相关蛋白(caspase3、caspase8和caspase9)的检测,结果显示转染后72h,Rep1组的Caspase 3活性极显著高于对照组和Rep2组(P<0.01),1型ORF3组的Caspase 3活性显著高于对照组和2型ORF3组(P<0.05),其他时间点各试验组与对照组三种凋亡蛋白含量差异不显著。这一结果可能表明,Du CV的Rep蛋白和ORF3蛋白发挥促细胞凋亡活性可能还存在其他非caspase凋亡途径。