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呋喃丹(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基甲氨基甲酸醋)是一种曾被广泛应用于农业生产方面的氨基甲酸酯类农药。一方面它是乙酰胆碱酯酶(即哺乳动物神经中枢系统信号传输过程中的一种关键酶)的抑制剂,另一方面它也是内分泌干扰物。虽然呋喃丹现在是我国的限制使用农药品种,但是它在环境中的残留仍然破坏着生态环境,威胁着人类健康。微生物降解是消除环境中呋喃丹污染的有效手段,但是目前对微生物降解呋喃丹的分子机制还未阐明。Sphingomonassp.CDS-1是本实验室保存的一株呋喃丹高效降解菌株,能以呋喃丹作为唯一碳源生长。前期实验表明,该菌首先在一个水解酶的作用下将呋喃丹水解为呋喃酚,然后又在一个氧化酶的作用下将呋喃酚转化为一种红色代谢产物。但是呋喃酚继续被降解途径中的关键基因还没有被报道。本文以菌株Sphingomonassp.CDS-1为材料,对其基因组进行测序分析,鉴定其降解呋喃丹和呋喃酚的关键基因,以期从基因水平上解析其降解机理。同时,对所克隆到的相关基因进行重组表达、蛋白纯化及其酶学特性的研究。主要取得以下结果:(1)通过对菌株CDS-1基因组进行比对分析,发现菌株CDS-1中的呋喃丹水解酶基因cehA与菌株AC100中的西维因水解酶基因cehA’存在99%的相似性,所编码的氨基酸仅有一个是不同的。然而并没有检测到该西维因水解酶CehA’对呋喃丹的降解活性。通过对菌株CDS-1的呋喃丹水解酶基因cehA进行点突变,获得菌株AC100的西维因水解酶基因cehA序列,在大肠杆菌中进行异源表达,检测其对呋喃丹的催化活性,发现西维因水解酶CehA’对呋喃丹也有很强的降解活性。(2)将菌株CDS-1中的呋喃丹水解酶基因cehA和菌株AC100中的西维因水解酶基因ceA’分别去掉5’端87个碱基(编码信号肽),并进行异源表达,检测它们对呋喃丹的降解活性。通过HPLC检测,发现去掉N端信号肽的呋喃丹水解酶CehA和西维因水解酶CehA’对呋喃丹都有很强的降解活性。(3)将菌株CDS-1基因组和菌株KN65.2已发布的基因组草图进行比对,找到一个可能的呋喃酚单加氧酶基因cfdC(NCBI 比对最高相似性为48%)。对该单加氧酶基因cfdC基因进行敲除和回补,发现敲除cfdC基因后的突变菌株CDQC丧失了降解呋喃酚的能力,而回补cfdC基因后的菌株CDQC-C又重新获得了降解呋喃酚的能力。这说明单加氧酶基因cfdC是菌株CDS-1中负责降解呋喃酚的关键基因。然而将基因cfdC在大肠杆菌中表达,却没有检测到其降解呋喃酚的活性。因此,推测cfdC可能需要特异性的还原酶组分。(4)通过对菌株CDS-1基因组比对分析,找到5个可能的orf,分别为orf1489,orf1586,orf3663,orf2902,orf1721,推测这5个orf编码的还原酶可能与呋喃酚单加氧CfdC配对,共同催化呋喃酚。因此,将这5个可能的还原酶基因分别构建到pET-29a载体上,获得5个重组表达质粒。将cfdC基因和T7启动子共同连接到pBBR1MCS-5载体上,获得含cfdC基因和T7启动子的重组表达质粒pBB-T7C。将这5个含可能还原酶基因的表达质粒分别与pBB-T7C质粒在E.coli BL21(DE3)中共表达,并通过全细胞催化检测其对呋喃酚的降解效果。最终获得两个有效果的还原酶基因,分别为orf3663和orf1721。这也说明,单加氧酶CfdC降解呋喃酚确实还需要一种还原酶的参与。(5)将呋喃酚单加氧酶基因cfdC和还原酶基因orf3663分别进行异源表达,并对表达产物进行纯化。建立酶促反应体系研究它们催化呋喃酚的酶学特性。反应体系中除了需要单加氧酶和还原酶,还需要添加辅因子FMN,NADH。通过LC-MS鉴定降解产物,推测菌株CDS-1中CfdC催化呋喃酚的产物是2,3-二氢-2,2-二甲基-4,7-二羟基苯并呋喃。