目的:肝脏疾病是一个巨大的全球性公共卫生问题,长期肝损伤无法获得及时有效的治疗将最终发展为肝衰竭或肝癌,显著降低病人生存质量甚至直接威胁生命。随着社会的进步,人类生活品质的显著提高,脂肪性肝病已跃升为第二大高发性肝病,仅次于病毒性肝炎,严重威胁着人类的健康。究其原因,快节奏的现代化生活以及不良的饮食习惯影响巨大。高脂饮食+CCl4诱导的慢性肝损伤模型是一个较为理想的慢性脂肪性肝病大鼠模型,用来模拟人因不良饮食习惯导致的慢性脂肪性肝病。为寻找早期肝炎临床诊断的生物标志物,本室前期运用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)从慢性肝炎病人血清中检测到的一个含量较高的多肽,即16个氨基酸多肽片段。经体外培养的细胞研究发现该多肽高表达可改变Hep G2细胞的增殖周期,促进细胞进入S期。迄今为止,尚无关于该多肽在慢性脂肪性肝病动物模型中生理、病理以及作用机制的研究。依据本室前期研究成果已证实该多肽针对静脉注射Con A诱导的急性肝损伤小鼠模型具有保护作用,推测其可能在慢性脂肪性肝病进展中同样发挥保护作用,故进行本研究。本研究利用高脂饮食+CCl4诱导的大鼠非酒精性脂肪肝模型研究该16个氨基酸多肽片段在非酒精性脂肪肝病中的治疗作用,并初步探讨其作用机制,为下一步临床肝病治疗提供实验依据。方法:1 16个氨基酸多肽片段治疗性给药对大鼠慢性脂肪性肝损伤的作用将56只雄性SD大鼠随机分为7组,除正常组分别在相应给药时点通过腹腔注射给予生理盐水并普通饲料进食外,其余各组大鼠均通过腹腔注射给予CCl4溶液每3天1次(3ml/kg),高脂饮食喂养,持续4周。将已分好组并完成慢性脂肪性肝损伤模型建立的56只大鼠,除正常组分别在相应给药时点通过尾静脉注射给予生理盐水外,其余各组大鼠分别经灌胃给予复方甘草酸苷稀释液(120mg/kg),降脂通络软胶囊稀释液(80mg/kg)或经尾静脉注射给予200、400、800μg/kg体重16个氨基酸多肽,每3天1次,持续治疗6周后,处死动物。收集大鼠血液,分离血清,采用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、TBIL、TG及CHOL水平。通过血清学指标观察该多肽治疗性给药对高脂饮食+CCl4诱导肝损伤的影响。2肝组织病理学检测治疗性给药结束后处死动物,分离肝脏,分别于同一位置切取适当大小的肝组织进行固定,石蜡包埋,行5μm连续切片后进行HE染色,于光学显微镜下观察肝组织病理学形态,并采集图像。3肝组织苏丹黑B脂肪特殊染色制作冰冻切片取组织时应注意不能太大太厚,大小为24×24×2mm左右为宜。行6-10μm切片后进行苏丹黑B染色,观察组织病理学形态,并采集图像。4肝组织MCP-1表达水平的测定应用免疫组化方法检测肝组织MCP-1蛋白表达水平,通过多功能真彩色细胞图像管理系统软件,捕获由显微镜采集的组织图片,选取其中阳性表达最强的5个视野进行计算,得出阳性细胞数及阳性细胞显色强度,从而得出免疫组化评分(IHS)的数值。探讨该多肽治疗性给药对高脂饮食+CCl4诱导肝损伤的作用机制。5肝细胞脂肪变性程度与MCP-1蛋白表达水平的相关性分析肝组织MCP-1蛋白表达水平在不同程度肝细胞脂肪变性中存在差异,通过HE染色观察到的肝细胞脂肪变性程度与MCP-1蛋白表达水平的相关性分析,分析不同程度肝细胞脂肪性变性对MCP-1蛋白表达的影响,从而进一步证实该多肽片段对肝脏保护作用的机制。结果:1 16个氨基酸多肽片段治疗性给药对高脂饮食+CCl4诱导的慢性肝损伤的影响多肽片段200μg/kg组、800μg/kg组、西药组、中药组及正常组血清ALT水平均显著低于模型组(P<0.05);多肽片段200μg/kg组、800μg/kg组及正常组血清AST水平均显著低于模型组(P<0.05),且多肽片段800μg/kg组血清AST水平显著低于西药组(P<0.05);各组血清TBIL水平均无明显差异;多肽片段200μg/kg组、400μg/kg组、800μg/kg组血清CHOL水平均显著低于模型组(P<0.01),其中多肽片段400μg/kg组、800μg/kg组血清CHOL水平均显著低于西药组(P<0.01);多肽片段200μg/kg组、西药组、中药组及正常组血清TG水平均显著低于模型组(P<0.01),多肽片段400μg/kg组、800μg/kg组血清TG水平与模型组无明显差异。2肝组织病理学检测病理切片显示,模型组大鼠肝组织中出现大片脂肪空泡,西药对照组治疗性给药显著改善肝细胞脂肪空泡情况。各剂量多肽片段组与中药组亦减轻了高脂饮食+CCl4诱导的肝细胞损伤,较模型组肝细胞脂肪空泡数量明显减少。3肝组织苏丹黑B脂肪特殊染色结果显示,模型组中央静脉和汇管区可见片状黑色点状脂肪颗粒;多肽片段200μg/kg组、400μg/kg组、中药组和西药组黑色脂肪颗粒较模型组相对减少;多肽片段800μg/kg黑色脂肪颗粒相较模型组显著减少。4 16个氨基酸多肽片段治疗性给药对肝组织MCP-1蛋白表达的影响免疫组化结果显示,西药组、中药组、多肽片段200μg/kg组、400μg/kg组和800μg/kg组MCP-1表达免疫组化总评分与模型组和正常组均有统计学差异(P<0.05);多肽片段各剂量组、西药阳性药物组和中药阳性药物组MCP-1表达免疫组化总评分之间差异无统计学意义(P>0.05)。5肝细胞脂肪变性程度与MCP-1蛋白表达水平的相关性分析肝细胞脂肪变性程度与MCP-1蛋白表达水平呈正相关,相关系数r=0.642,P<0.01。并且肝细胞脂肪变性阳性细胞数越多,其肝组织MCP-1蛋白的阳性细胞数也越多,相关系数r=0.566,P<0.01,有统计学差异。结论:1外源性给予16个氨基酸多肽片段不仅能够降低脂肪肝大鼠血清ALT、AST、CHOL、TG水平,还能够减少肝脏空泡样变,使肝细胞恢复正常,可有效治疗高脂饮食+CCl4诱导的大鼠脂肪肝。2外源性给予16个氨基酸多肽片段减轻高脂饮食+CCl4所引起慢性肝损伤的机制可能与抑制肝组织MCP-1表达有关。