金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种常见的食源性致病菌,其引起的食物中毒位于全球食物中毒事件的第二位。S.aureus对抗生素敏感,极易引起耐药性。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)是其中一种严重威胁人类健康的多重耐药菌,具有较高检出率和死亡率,已成为全球关注的公共卫生问题。近年来,常用的抗MRSA药物相继出现了耐药菌,因此寻找预防和控制MRSA传播与污染的新型抗菌剂已迫在眉睫。乳糖酸是一种天然存在于发酵乳制品中的高附加值有机酸,其抑菌性能已逐渐受到关注。本课题组前期研究发现,乳糖酸不仅对常见的食源腐败菌和致病菌具有抑制作用,而且对多重耐药菌MRSA也具有较好的抑菌活性,但抑制MRSA的作用方式和机理需要深入探讨。本文以MRSA为目标菌株,从细胞水平、蛋白水平和代谢水平三个层面,深入解析乳糖酸对MRSA的抑制效果、作用位点及作用方式,逐层递进地探究乳糖酸抑制MRSA的作用机理,并在此基础上评价了乳糖酸对全脂鲜牛乳的抑菌效果。主要研究结果如下:(1)通过对最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)、生长曲线和杀菌动力学等研究,评价乳糖酸对MRSA的抑菌活性。结果表明,乳糖酸对MRSA具有抑菌和杀菌特性,其MIC和MBC分别为18.75 mg/m L和50.00 mg/m L。碱性磷酸酶活性、流式细胞仪、蛋白质和K~+泄漏以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验结果表明,乳糖酸可能破坏了细胞壁和细胞膜的完整性,增大细胞膜通透性,导致细胞内容物外泄,影响细菌蛋白质的含量或活性。通过扫描电镜和透射电镜观察,菌体细胞发生了明显的超微结构和形态变化,证实了乳糖酸对细胞壁和细胞膜的破坏作用。凝胶阻滞和竞争结合实验证实,乳糖酸以嵌入式与基因组DNA相互作用,从而干扰正常的细胞功能。此外,乳糖酸还能显著抑制MRSA生物被膜的形成。(2)采用所有理论碎片离子连续窗口采集(SWATH-MS)技术进行定量蛋白质组学研究,分析经乳糖酸处理后MRSA胞内发生显著变化的100种差异表达蛋白质(28种上调、72种下调),通过平行反应监测(PRM)和荧光定量PCR(RT-PCR)技术及活性氧(ROS)测定等对蛋白质组学结果进行验证。结果表明,乳糖酸通过裂解细胞壁成分壁磷壁酸和增加细胞壁的净负电荷,破坏细胞壁的完整性。乳糖酸通过抑制内源性抗氧化剂的活性,导致ROS在MRSA胞内累积,从而引发胞内氧化应激、DNA损伤、细胞壁破裂及细胞膜通透性改变等一系列损伤。乳糖酸阻断DNA修复途径,导致MRSA基因组不稳定。乳糖酸干扰嘌呤核苷酸的从头合成途径,说明乳糖酸能影响嘌呤核苷酸的正常合成。乳糖酸抑制RNA合成,降低m RNA解码速度和准确性,说明乳糖酸能阻碍蛋白质合成。乳糖酸通过抑制Co A生物合成,阻碍碳水化合物代谢和磷酸化糖生成、精氨酸合成和谷氨酸转运,进而影响MRSA的能量及营养供应。乳糖酸抑制MRSA毒力、对宿主细胞的粘附性及生物膜的形成,说明乳糖酸能降低MRSA对宿主的致病性。乳糖酸干扰核糖体50S亚基的构象发生改变,说明能减少MRSA对乳糖酸产生耐药性。(3)采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术进行非靶标代谢组学研究,分析经乳糖酸处理后MRSA胞内发生显著变化的98种差异表达代谢物(74种上调、24种下调),通过测定磷酸果糖激酶、顺乌头酸酶活性及ATP含量对代谢组学结果进行验证。结果表明,乳糖酸通过诱导壁磷壁酸水解酶表达分解壁磷壁酸,加速细胞壁裂解,从而破坏细胞壁的完整性。乳糖酸通过下调不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸(UFAs/SFAs)比率,改变细胞膜脂肪酸的构成;降低内源性抗氧化剂活性,诱导ROS累积;开启细胞膜离子通道,从而增大细胞膜通透性,破坏细胞膜完整性,造成细胞内容物外泄。乳糖酸通过阻断脱氧核苷酸合成,抑制DNA合成和修复,造成MRSA基因组不稳定。乳糖酸能促进嘌呤核苷酸的分解代谢,降低嘌呤核苷酸的从头合成代谢,从而阻碍核酸和蛋白质的合成。乳糖酸抑制糖酵解和三羧酸循环代谢途径,阻断ATP合成,造成能量供应不足。乳糖酸抑制核黄素代谢,影响细胞的生理功能和细胞活性。乳糖酸干扰电子传递,说明乳糖酸能减少ATP合成。(4)以经过巴氏杀菌的全脂鲜牛乳作为模拟体系,研究乳糖酸影响真实食物基质中MRSA的抑菌活性,评估贮存了12 d的全脂鲜牛乳的感官特性,评价乳糖酸对全脂鲜牛乳质量的影响。结果表明,乳糖酸对4℃贮存全脂鲜牛乳中的MRSA菌落总数具有显著地抑制作用,延迟感官品质的恶化。