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小开放阅读框(small open reading frame,sORFs)作为<100个连续密码子所编码的基因片段,在许多重要的生物进程中发挥着重要的作用,其能够调控细胞的增殖、分化、信号传递等多种生物学进程,具有多种生物学效应,家蚕质型多角体病毒1型(Bo b x mori cypovirus type-1,BmCPV-1,以下简称 BmCPV)作为呼肠孤病毒家族的一员,是质型多角体病毒的典型种,能够特异性感染家蚕中肠组织。BmCPV的基因组由S1-S10 dsRNAs片段构成,通常认为包括BmCPV在内的质型多角体病毒基因组的每一个dsRNA片段为单顺反子,编码一种蛋白。目前已有研究报道认为部分病毒可以编码功能性sORF,但BmCPV的基因组dsRNA能否编码功能性sORFs还未见报道。1、BmCPVS5-sORF 的功能BmCPV S5 dsRNA编码非结构蛋白NS1,利用sORF Finder软件预测发现S5 dsRNA的反义链(-)具有编码一个sORF的潜能,本文将该sORF命名为S5-sORF-1089,简称S5-sORF。设计特异性引物PCR扩增S5-sORF的编码序列,扩增产物克隆进原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了 S5-sORF多克隆抗体。细胞免疫荧光检测结果显示,在感染BmCPV的细胞核中可检测到S5-sORF小肽,表明BmCPV确能编码sORF。为了探讨S5-sORF的功能,我们构建了过表达S5-sORF转化细胞,qPCR检测结果显示,BmCPV在S5-sORF转化细胞中的增殖被抑制,过表达S5-sORF对细胞凋亡、免疫通路相关基因的表达无明显影响;进一步通过基于BmCPV体外转录的病毒RNA的反向遗传学系统,构建了 S5-sORF起始密码突变的重组BmCPV-S5-sORFmut,qPCR检测结果显示,BmCPV-S5-sORFmut的S1基因的表达水平高于重组BmCPV病毒,推测S5-sORF编码的小肽对病毒的增殖有抑制作用;用人工合成的带有穿透肽的S5-SORF小肽处理培养细胞,结果显示BmCPV的增殖以剂量依赖方式被抑制,进一步证实S5-sORF编码的小肽可抑制病毒的增殖。利用Co-IP法筛选S5-sORF的互作蛋白,通过质谱鉴法共鉴定到TFAP4,Akirin蛋白和小分子泛素化修饰蛋白等7种互作蛋白,推测S5-sORF能与这些蛋白互作调节病毒的增殖。另外,我们还发现BmCPV的增殖在起始密码缺失的S5-sORF的体外转录RNA的转染细胞中受到抑制,推测S5-sORF的RNA也可能作为NS1基因的反义RNA发挥作用。2、BmCPV S10-sORF 的功能BmCPV S10 dsRNA编码多角体蛋白基因,利用sORF Finder软件预测发现S10 dsRNA的正义链(+)具有编码一个sORF的潜能,本文将该sORF命名为S10-sORF-393,简称S10-sORF。将S10-sORF序列克隆进原核表达载体进行表达,利用重组表达蛋白免疫小鼠制备S10-sORF多克隆抗体,细胞免疫荧光检测结果显示,S10-sORF小肽主要定位于细胞质内。qPCR检测结果显示,S10-sORF的mRNA水平与多角体蛋白基因的mRNA水平相当,推测S10-sORF和多角体蛋白基因共用同一个mRNA模板翻译蛋白;为了探讨S10-sORF对BmCPV自身及宿主细胞的影响,本研究构建过表达S10-sORF转化细胞以及过表达S10-sORF起始码后端序列突变的S10片段(S10-sORFmut))转化细胞系,qPCR检测结果显示,BmCPV在二种转化细胞中增殖均受到抑制,且发现S10-sORF过表达抑制BmSOCS6(JAK/STAT 通路)、BmPGRP-LB(Imd 通路)、Bmago2(RNAi 通路)和Bmdrc2(RNAi通路)基因的表达,提高caspase基因表达。进一步通过基于BmCPV体外转录的病毒RNA的反向遗传学系统,构建了 S10-sORF起始密码后端序列突变的重组 BmCPV-S10-sORFmut病毒,qPCR 检测结果显示,rBmCPV-S10-sORFmut病毒的增殖水平低于重组BmCPV病毒;细胞转染缺失起始密码的S10-sORF体外转录RNA对BmCPV的增殖有一定的抑制作用。利用Co-IP法筛选S10-sORF的互作蛋白,通过质谱鉴法共鉴定到14种候选互作宿主蛋白,主要与转录调控、蛋白翻译等相关联。3、BmCPV入侵BmN细胞途径的研究由于到目前为止,对于BmCPV感染细胞的途径仍然不是很清楚,为了研究BmCPV感染细胞的途径,通过电镜观察BmCPV早期感染BmN细胞的切片发现,BmCPV进入细胞的途径可能与内吞作用相关。据此,利用内吞抑制剂来研究BmCPV的感染途径,结果表明,丹磺酰胺,氯丙嗪,染料木黄酮及PP2均可抑制BmCPV的感染,同时氯丙嗪对于BmCPV感染的抑制效果最强,推测BmCPV通过依赖于网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞。为进一步了解染料木黄酮及PP2对于BmCPV感染性的抑制作用,通过病毒粒子与溶酶体共定位后发现,经药处理的细胞其能够诱发BmCPV病毒粒子的无效感染,即将病毒错误运输至溶酶体,使得BmCPV被降解,从而抑制BmCPV的感染作用。