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巴斯德毕赤酵母表达系统由于具有诸多优势而被广泛应用于异源蛋白的表达和工业化生产当中。目前研究主要使用天然甲醇诱导型AOX1启动子（pOX1）,以甲醇为单一基础碳源进行外源蛋白的诱导发酵生产。但在毕赤酵母高密度发酵生产中,甲醇代谢过程耗氧大、产热高,补料控制工艺复杂,限制了大规模生产的应用。虽然很多研究致力于对PAOX1的转录调控体系进行改造,或是寻找毕赤酵母中其它不依赖甲醇的天然启动子,但是效果均不够理想,表达强度及调控灵敏度都不如POX1。随着合成生物学的发展,基于已鉴定好的PAOX1转录调控机制,利用合成生物学的方法对PAOX1进行定向改造,为解决这一问题提供了新的思路和方法。此前本实验室通过对PAOX1转录调控机制的研究,鉴定了毕赤酵母甲醇代谢相关的转录激活因子以及抑制因子,并初步得到了甲醇信号的传导途径及PAOX1的转录调控模型。本文在此前研究基础上,结合PAOX1相关转录调控元件,分别基于CRISPR-dCas9以及乳糖操纵子元件在毕赤酵母中设计和验证了两套转录信号增益器件。其中基于乳糖操纵子元件设计的CSAD5器件在葡萄糖、甘油、甲醇等多种碳源条件下都表现出了非常好的转录信号增益效果,且在相同条件下达到PAOX1强度的5倍左右以及PGAP强度13倍左右,远超目前报道的最高水平。为了验证CSAD5器件驱动异源蛋白表达的能力,选取人胰岛素前体、淀粉酶和人乙肝表面抗原等三种不同外源蛋白,分别在葡萄糖和甲醇条件下进行摇瓶水平发酵,比较与传统PAOX1甲醇诱导体系之间的差异。结果表明,以甲醇或者葡萄糖为碳源进行发酵,CSAD5器件均可高效驱动异源蛋白的表达。在以葡萄糖为碳源时,CSAD5器件驱动人胰岛素前体、淀粉酶和人乙肝表面抗原表达的能力分别是PAOX1的1.3倍、1.7倍和8.4倍。在以甲醇为碳源时,CSAD5器件驱动人胰岛素前体和淀粉酶表达的能力与PAOX1甲醇诱导体系相当,驱动人乙肝表面抗原表达的能力是PAOX1的8倍以上。此外,在5 L反应器水平探索了CSAD5驱动人胰岛素前体表达的发酵工艺,分别探究了低流速甲醇补料工艺和以葡萄糖为单一碳源的发酵工艺,经过优化,得到了一套最佳的以葡萄糖为碳源的发酵工艺。该工艺整个发酵过程均以葡萄糖为碳源,在分批结束以15.5 ml/（h·L broth）的流加速率补加葡萄糖至发酵结束。与甲醇诱导工艺相比,该工艺在保持产量相当的同时,控制更加简单,氧耗更低,产热更少。最后通过增强抗生素筛选压力提高异源基因拷贝数,获得了一株胰岛素前体高产的毕赤酵母菌株,利用优化的培养工艺在5 L反应器水平发酵生产,胰岛素前体产量在108 h达到1.85 g/L,为目前报道以葡萄糖为碳源,生产人胰岛素前体的最高水平。该研究为胰岛素前体的工业生产以及合成生物学在毕赤酵母改造中的应用提供了新的思路。