海南冬青提取物调控NF-KB诱导细胞凋亡抑制B16-F10恶性黑色素瘤增殖

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目的近年来,恶性肿瘤已成为严重威胁全球人类健康、导致死亡的一大主要疾病。化学药物治疗仍是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段之一,但由于其毒副作用极大,尤其对骨髓造血系统、消化系统等重要脏器产生的毒性使患者难以维持或接受治疗而导致死亡、以及治疗后产生的多药耐药问题仍然难以克服,因此亟需寻找新的治疗药物或方法。提取自中药或天然药物的活性成分具有多靶点作用、生物活性高、多数药物毒副作用轻微、且因多靶点作用不易产生耐药等优势已成为全球抗肿瘤药研究的热点与重点。海南冬青乙醇提取物(Ethanol extract of Ilex hainanensis Merr., IME)是从冬青科冬青属植物海南冬青的树叶中提取得到,本课题组前期研究发现其具有良好的抗炎活性,炎症与癌症之间存在着必然的相关性。因此,本论文在抗炎研究的基础上进一步探索其抗肿瘤活性,并阐明潜在的分子机制,为将IME研究成一种新型的抗肿瘤药提供实验支撑。方法第一部分:IME体外抗恶性肿瘤细胞活性筛选体外培养BGC-803、MGC-803、SGC-7901、NCI-H460、A549、LETP-a-2、HepG2、 SMMC-7721、MHCC、Hep3B.PC-3.MDA-MB-231 及 Hela 13种人源肿瘤细胞株,B16-F10、H22 及 Lewis 3种鼠源肿瘤细胞株,采用MTT法或CCK-8法检测IME对肿瘤细胞的增殖抑制率,并计算半数抑制浓度IC 50(μg/mL)。第二部分:IME抑制B16-F10鼠源恶性黑色素瘤增殖研究1.IME对B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤生长的影响B16-F10细胞接种至C57BL/6J小鼠右侧腋窝皮下,建立B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠模型,随机分为模型组、IME 25,50,100,200 mg/kg组和阳性对照(达卡巴嗪70ng/kg)组。分别按上述剂量灌胃给予受试品,模型组灌胃等量溶媒(0.5%羧甲基纤维素钠);阳性对照组腹腔注射达卡巴嗪,每2天1次。每天观察小鼠状态并称量体重和进食量,每3天测量小鼠瘤体积;连续干预14天,取瘤,称量瘤重计算抑瘤率(%);取部分瘤组织制作石蜡切片,H&E和TUNEL染色;取小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏称重,计算脏器系数并进行组织学检查。2.IME对B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠生存期的影响B16-F10细胞接种至C57BL/6J小鼠右侧腋窝皮下,建立B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠模型,随机分为模型组、IME50,100,200mg/kg组和阳性对照(达卡巴嗪70mg/kg)组。分别按上述剂量灌胃给予受试品,模型组灌胃等量溶媒(0.5%羧甲基纤维素钠);阳性对照组腹腔注射达卡巴嗪,每2天1次。连续干预14天后,停药观察荷瘤小鼠生存时间,实验第50天停止观察,绘制生存曲线,计算生存延长率。第三部分:IME抑制B16-F10鼠源恶性黑色素瘤增殖的机制研究体外培养B16-F10鼠源恶性黑色素瘤细胞,IME处理48 h后,采用流式细胞术观察IME对B16-F10细胞周期和凋亡的影响;RT-PCR检测IME对NF-κB-p65, Bcl-2, Bcl-xL,以及Bax基因表达的影响;Western blot检测IME对细胞周期相关蛋白(CyclinD, CyclinE,CDK4,CDK2)、核转录因子 NF-κB-p65、抑癌基因P53、及细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2, Bcl-xL,Bax,细胞色素C)表达的影响;酶标法检测IME对Caspases-3,-8,-9活性的影响。结果第一部分:IME体外抗恶性肿瘤细胞活性筛选IME对受试的13种人源肿瘤细胞株及3种鼠源肿瘤细胞株以浓度与时间依赖性抑制细胞增殖,显示出较强的体外抗肿瘤活性。其中分别对鼠源B16-F10恶性黑色素瘤细胞和人源HepG2肝癌细胞的IC50值最小,抑制作用最强。第二部分:IME抑制B16-F10鼠源恶性黑色素瘤增殖研究1.IME抑制B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤生长B16-F10荷瘤小鼠抑瘤率实验,与模型组比较,IME显著降低B16-F10荷瘤小鼠的瘤体积和瘤重。IME 25,50,100,200mg/kg组的肿瘤抑制率分别为38.41%、43.01%、49.25%、68.62%。瘤组织的H&E和TUNEL染色显示IME可引起瘤内大面积的组织坏死和细胞凋亡。IME干预期间,B16-F10荷瘤小鼠未出现明显毒副反应症状。组织形态学检查小鼠重要脏器未见异常。2.IME延长B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠生存时间B16-F10荷瘤小鼠生存实验,模型组小鼠在实验的第33天全部死亡,此时IME 50,100,200 mg/kg组分别有70%、80%、90%的小鼠存活。第50天实验结束,阳性对照达卡巴嗪组小鼠全部死亡,IME 100 mg/kg组与IME 200 mg/kg组分别有1/10只(10%)、2/10只小鼠(20%)存活。根据Log-rank时序检验,与模型组比较,IME在50、100、200 mg/kg剂量时对荷瘤小鼠的生存延长率分别高达45.10%、45.10%、62.75%,表明IME可显著延长荷瘤小鼠生存时间,IME显示出显著的抗恶性黑色素瘤活性。第三部分:IME抑制B16-F10鼠源恶性黑色素瘤增殖的机制研究MTT检测结果显示IME呈时间与浓度依赖性抑制B16-F10鼠源恶性黑色素瘤细胞体外增殖;流式细胞仪检测显示IME诱导B16-F10细胞G1/S期细胞周期阻滞和细胞凋亡;RT-PCR检测结果显示IME显著下调NF-κB-p65、Bcl-2, Bcl-xL基因表达,同时显著上调Bax基因表达;Western blot检测结果显示IME抑制调控G1/S细胞周期进程的细胞周期相关蛋白CyclinD, CyclinE, CDK4, CDK2表达,抑制NF-κB-p65入核;显著下调抗细胞凋亡蛋白Bcl-2, Bcl-xL表达,同时显著上调抑癌基因P53及促细胞凋亡蛋白Bax表达,并促进细胞色素C从线粒体中释放;酶标法检测结果显示IME增加Caspases-3,-8,-9活性。结论(1)IME体外具有抗恶性肿瘤细胞活性,以鼠源B16-F10恶性黑色素瘤细胞与人源HepG2肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)为最低,抑制作用最强。(2)IME有效抑制B16-F10恶性黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤生长,显著延长荷瘤小鼠的生存时间,且未见毒副反应症状。(3)IME可调控B16-F10小鼠恶性黑色素细胞内G1/S细胞周期相关蛋白表达,抑制转录因子NF-κB-p65入核,上调抑癌基因P53蛋白表达;调控细胞凋亡相关蛋白,激活Caspase级联反应,从而诱导B16-F10细胞G1/S期细胞周期阻滞、细胞凋亡,发挥抗恶性黑色素瘤作用。(4)IME体内、外均显示出较强的抑制肿瘤增殖活性,且无明显不良反应,可望成为一种高效、低毒的天然抗肿瘤候选物。
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