肺是重要的生命器官之一,肺部的恶性疾病如肺癌其发病率在男性癌症患者中居首位,很多肺部疾病或全身疾病进展到一定程度,也会对肺产生致命的打击发生急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征,使病死率增加。一般大家都认为爱运动的人体质好,而且抵抗疾病的能力会明显增强。研究发现当人们在运动时,肌肉会分泌一种激素,促进能量代谢,研究人员以希腊女神Iris的名字将这种激素命名为irisin。运动使肌肉中转录激活蛋白PGC1a增加,上调肌肉中FNDC5的mRNA表达,并促进其剪切成的多肽片段,就称为irisin。Irisin可以诱导棕色脂肪变,这些棕色变的脂肪细胞可以用于燃烧脂肪产生热量从而避免胰岛素抵抗和肥胖[1]。现有的研究表明Irisin除了可以改善肥胖状态[2],在慢性肾脏疾病的患者的irisin的表达水平是下降的[3],irisin通过抑制ox-LDL诱导的细胞炎症和凋亡显著降低apolipoprotein E缺乏的小鼠的动脉粥样硬化[4],irisin通过AMPK-SREBP2信号抑制肝胆固醇的合成[5],慢性阻塞性肺疾病的患者血清中irisin的表达水平是下降的[6],患有多囊卵巢综合征的妇女血清中的irisin的基础水平增高[7]。Irisin在多种肿瘤患者中的表达水平下降,包括乳腺癌,胃癌,卵巢癌[8-10]。近期的研究表明,irisin在全身各个系统都有保护性作用,然而除了很少的慢性阻塞性肺疾病的一些临床血液学检查的数据,irisin在肺部疾病比如肺癌以及急性肺损伤中是否扮演者角色尚未知。在本课题中,本研究应用细胞实验和动物实验,从分子水平和蛋白水平研究了:1)Irisin对肺癌细胞的作用,其可能的信号机制以及与肺癌细胞的上皮细胞间质化的关系;2)Irisin在小鼠急性肺损伤引起的炎性病变过程中是否有保护性作用,以及如何参与损伤修复的。本研究发现了:1)Irisin通过阻断PI3K/AKT/Snail信号通路抑制了肺癌细胞的EMT,抑制了肺癌细胞的增殖和侵袭转移;2)Irisin可抑制脂多糖诱导的小鼠肺损伤的炎症反应和细胞凋亡,其机制可能与Irisin抑制MAPK和NF-κ B信号通路的激活从而抑制脂多糖诱导的A549细胞的增殖和凋亡有关。这些新发现的作用机制可能使irisin成为一种新型的抗癌靶点和研究治疗急性肺损伤的新药物。第一部分 Irisin抑制肺癌细胞的增殖转移及作用机制研究中文摘要背景近年来肺癌的发病率不断上升,虽然随着新型化疗药的问世、手术及放疗的改进和精准分子医学的发展,肺癌患者的中位生存时间总体上较前有明显增长,但是5年生存率依然是非常低。因此,医学界不断尝试着研究其发病的病理生理学机制,寻找更有效的治疗方法。癌症发生的机制是非常复杂的,正常组织能够通过调控促增殖信号的产生和释放来控制细胞生长、分裂周期,并引发细胞凋亡,从而确保细胞处于正常的内稳态和数量,以维持组织有正常的结构和功能,而肿瘤细胞通过解除对这些信号的管制逃避了细胞正常的生长抑制和凋亡。EMT(上皮细胞间质化)可以发生在很多动物物种胚胎发育的关键阶段。EMT的过程使间叶细胞变成容易迁移的形态,上皮细胞和间叶细胞间产生相互作用使细胞迁移并参与器官形成。EMT可以修复损伤的组织,但是也可能造成器官纤维化和促进肿瘤生长。EMT是癌症发展和转移的主要和早期途径之一,其具体机制是肿瘤细胞上皮间质化形成间充质细胞,具有了迁移能力,并同时在一定程度上也能维持原有的上皮细胞的特性,所以肿瘤细胞能够在身体其他部位形成肿瘤转移灶。E-cadherin表达缺失是EMT发展的一个标志性事件,与转移性癌症的发展呈正相关。很多信号通路的改变都能引起E-cadherin表达下降,并促进细胞从上皮性到间叶性的转变。运动产生的生物蛋白Irisin已经被证实对多个系统的疾病有保护性作用,其中包括肿瘤。迄今为止,研究发现的irisin的表达水平与能量平衡和代谢相关。近期的一些研究表明,Irisin在卵巢子宫内膜异位症和粘液癌中起了保护性作用。多囊卵巢综合征患者血清中的irisin的基础表达水平增高。而在慢性肾脏疾病的患者中,irisin的表达水平是下降的,和肾小球滤过率保持一致。乳腺癌患者中irisin的表达也是下降的。Irisin在多种疾病中被发现可以促进能量代谢,免疫调节,影响多种疾病的慢性炎症,包括胃癌。然而,irisin在肺癌中是否扮演者角色尚未知。目的在肺癌细胞系细胞中研究irisin对肺癌细胞的迁移、增殖以及侵袭的影响,阐明irisin参与肺癌细胞侵袭转移的分子机制。方法1.人非小细胞肺癌细胞系A549和小细胞细胞系NCI-H446细胞的培养。2.MTT法测细胞增殖。3.划痕实验测细胞迁移。4.Transwell侵袭实验测细胞迁移。5.Western blot实验:将不同条件下获得的细胞裂解,测定蛋白浓度,调整到相同浓度后凝胶电泳,抗体孵育后曝光来检测目的蛋白的表达。6.统计学分析。结果1.Irisin抑制肺癌细胞的增殖。用MTT法检测发现,irisin在20-50nM的浓度范围内能够明显抑制A549细胞的增殖。进一步实验发现20nM irisin处理A549细胞24h,可以显著抑制细胞增殖。2.Irisin抑制肺癌细胞的转移。将20nMirisin加入培养液培养A549细胞24h,Transwell实验和划痕实验均发现肺癌细胞的转移被显著抑制。3.irisin通过抑制肺癌细胞的PI3K/AKT信号通路来抑制EMT的表达。(1)选择了非小细胞肺癌细胞系A549和小细胞肺癌细胞系NCI-H446来完成这个实验。(2)20nM irisin孵育细胞24h可以显著抑制间叶细胞的标记物N-cadherin和vimentin,上调上皮细胞的标记物E-cadherin的表达。(3)20nM irisin孵育细胞24h降低磷酸化PI3K/AKT蛋白、上调总PI3K/AKT蛋白的表达,而LY294002作为PI3K抑制剂,完全逆转了以上现象。4.Irisin通过抑制PI3K/AKT信号通路使Snail表达下调。(1)Snail通过转录抑制E-cadherin的表达,是E-cadherin的关键调节蛋白。20nM irisin显著抑制Snai1的表达。(2)10uMLY29400孵育细胞2小时,Snai1表达上调,这些结果表明irisin通过阻断PI3K/AKT通路来抑制Snai1的表达。结论1.本研究是首次发现了 irisin和肺癌的关系。2.Irisin抑制了肺癌细胞的增殖和转移,这种新发现的作用机制可能使irisin成为一种新型的抗癌小分子。3.Irisin通过阻断PI3K/AKT/Snai1信号通路抑制了肺癌细胞的EMT,减缓了肺癌的增殖转移。背景急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是比较严重的临床症状,主要表现为过度的炎症反应、脓毒血症、通气功能受损、肺毛细血管弥漫性损伤和肺水肿。ALI的最严重的形式被称为ARDS。ALI/ARDS的病人常常出现病情的急性发作,氧合下降,胸片显示双肺磨玻璃影,呼吸频率增加,肺水肿形成和非心源性的呼吸衰竭,临床上ALI/ARDS有比较高的发病率和死亡率。既往研究揭示了导致ALI/ARDS的部分机制,比如与氧化应激和炎症反应相关的ROS的堆积,与炎症信号通路激活有关的ALI/ARDS发生的分子机制包括p-38MAPK,AKT和NF-κB信号通路。Irisin是一个代谢相关的因子,可以诱导棕色脂肪变,它在肥胖相关的疾病比如动脉硬化,胰岛素抵抗和2型糖尿病中都起到保护性作用。最近的研究证明在2型糖尿病中,irisin通过调节AMPK信号通路促进脂肪酸氧化和葡萄糖利用,通过调节PI3K/AKT信号通路来抑制肝糖原糖异生作用。Irisin通过AMPK-Akt-eNOS-NO信号通路增加乙酰胆碱使血管舒张从而降低血压。某些研究也揭示了 AMPK信号通路参与了 irisin在不可预知的慢性情绪应激大鼠的抑郁行为中的调控。Irisin通过激活AMPK-PI3K-Akt-eNOS信号通路对糖尿病人的动脉粥样硬化性血管性疾病有治疗作用。Irisin也能够通过抑制ROS/p38 MAPK/NF-κ B信号通路修复氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞功能失调。尚未有被报道出来的证据显示irisin与ALI/ARDS相关,本研究假设在ALI/ARDS发生的过程中,irisin通过介导与炎症相关的信号通路是否可以影响到细胞存活、细胞凋亡、炎症介质和纤维增生的表达来阐述irisin对肺损伤的作用及分子机制。目的本研究的目的是探索irisin在LPS诱导的急性肺损伤的肺泡上皮细胞增殖和凋亡中的作用,以及因此而改变的可能的信号通路变化和分子机制。材料和方法1.建立急性肺损伤的动物模型:选用年龄6-8周的雄性C57BL/6J小鼠,把LPS配置成浓度为2mg/ml的工作液,然后把LPS用PBS配制成100 μ 1体积,称量小鼠体重,实验组以浓度5 μg/g予鼻内滴注法造模,对照组给予鼻内滴注生理盐水(SAL),治疗组在LPS造模后每天腹腔注射给予纯化的irisin,浓度为0.5μ g/g。2.纤维化组织HE染色后,图像分析ALI损伤的程度。3.Smith评分分析肺组织损伤程度。4.用Real-timePCR法来在检测A549细胞中,LPS诱导的炎症因子的表达。5.蛋白表达用Western blot方法检测。6.A549细胞培养进行细胞学实验。7.用MTT法检测肺泡上皮细胞的增殖。8.用TUNEL染色检测肺泡上皮细胞的凋亡。9.统计学分析。本研究所有数据用预测统计分析软件SPSS 18.0版本分析,正态分布数据用单因素方差分析,非参数变量使用U检验。结果1.Irisin抑制了细胞的炎症反应以及小鼠模型中LPS诱导的肺损伤的病理改变。动物实验获得LPS诱导ALI的实验组小鼠和irisin治疗组小鼠的肺组织切片,观察到实验组小鼠肺组织内的炎症细胞浸润、间质性和肺泡性水肿、出血、透明质膜形成和弥散性肺泡损伤,而治疗组分析结果显示irisin能显著减轻这些损伤。组织学Smith评分irisin对于减轻肺组织的损伤呈现时间性和浓度性依赖。2.Irisin抑制了 LPS诱导的A549细胞的炎症因子的表达。A549细胞用LPS(10 μg/ml)刺激后,分别加入不同浓度的irisin(0,10,20和40nM)分别反应0,6,12,24和48小时,MTT分析显示20nM irisin能够显著抑制细胞活性。因此本研究选用20nM的irisn做后续的实验。LPS刺激后,A549细胞中IL-6,MCP-1,IL-1 β和TNF-a的mRNA表达水平明显上升,而Irisin抑制了这种炎症表达。3.在LPS诱导的急性肺损伤中,irisin抑制了细胞凋亡。在LPS诱导的A549细胞中用TUNEL检测显示凋亡指数(TUNEL阳性细胞/DAPI染色细胞)显著增加,irisin显著抑制了细胞凋亡和caspase-3的表达,提高了 Bcl-2的表达以及抑制Bax的表达。这些数据表明在细胞研究中,irisin抑制了细胞凋亡。4.Irisin减弱了 LPS-诱导的MAPK和NF-κB信号通路的激活。用western blot方法分析了 irisin在LPS-诱导的激活的MAPK和NF-κ B信号通路中的作用,结果显示在LPS诱导的A549细胞中,磷酸化p38和磷酸化的NF-κBp65的表达升高,而irisin预处理可以降低这些蛋白的表达。对核和胞浆的蛋白检测分析结果显示irisin能够显著降低NF-κB(p65)的核表达,提高其在胞浆内的表达。结论1.Irisin抑制了 LPS诱导的小鼠肺损伤的炎症反应。2.Irisin抑制了 LPS诱导的细胞凋亡。3.Irisin提高了 LPS诱导的A549细胞Bcl-2的表达,降低了 Bax的表达。4.Irisin通过抑制MAPK和NF-κ B信号通路的激活来抑制LPS诱导的A549细胞的增殖和凋亡。