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目的应用shRNA介导的RNA干扰（RNAi）研究HBV X基因（HBX）表达水平和三氧化二砷（As2O3）对HepG2细胞凋亡及p53表达和活性的影响。方法从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因，利用pCEP4和pcDNA3.1（+）二者多克隆位点的特点，选用pGEM?-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X，分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1（+）-X。应用脂质体介导转染pCEP4-X和pcDNA3.1（+）-X入HepG2细胞，Hygromycin和Neomycin筛选阳性细胞克隆，传代培养后PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定HBX的表达。选用cGFP标记的pRNAT-U6.1／Neo构建序列特异性的shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和序列无关对照pXi-3，转染入HepG2-pCEP4-X细胞，Hygromycin和Neomycin筛选GFP阳性的细胞克隆，传代培养。RT-PCR和Western Blot分析HBX的表达水平。以2μmol／LAs2O3处理HepG2细胞和HepG2-pCEP4-X细胞36小时，以未处理细胞为对照，流式细胞术分析细胞凋亡比和细胞周期，Caspase 3／cpp32比色化验试剂盒细胞测定裂解物caspase 3活性，改进的ELISA法检测p53总量和相对活性吸光度。shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和pXi-3转染HepG2-pCEP4-X后再次分析细胞凋亡比、细胞周期、caspase 3活性以及p53表达和活性。结果从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy、pCEP4和pcDNA3.1（+），酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1（+）-X构建成功。转染后成功筛选出耐Hygromycin或Neomycin的阳性细胞克隆，并能传代培养。PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定证实HBX表达。shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和pXi-3转染至HepG2-pCEP4-X后RT-PCR和Western Blot分析表明序列特异性pXi-1、pXi-2能显著抑制HBX的表达，而序列无关对照pXi-3则对HBX的表达水平无影响。2.0μmol／L As2O3作用36小时后细胞凋亡比明显增高，但shRNA表达质粒转染过程也可使细胞凋亡比增高。不同HBX表达水平的细胞组As2O3作用后细胞凋亡比有统计学差异（P＜0.05），HBX表达后凋亡比下降，序列特异性RNAi抑制HBX表达后凋亡比可再次增高。2.1μmol／L As2O3作用36小时后G1期细胞减少（P＜0.01），G2／M期细胞增多（P＜0.01）。但不同HBX表达水平的细胞As2O3作用后G1期、G2／M期和S期细胞构成均无统计学差异。各处理组细胞裂解物反映caspase3活性的405nmOD值有统计学差异（P＜0.01），但是否予As2O3对同种细胞的caspase3活性无统计学影响（P＞0.05），而不同HBX表达水平的细胞As2O3作用后caspase3活性却有统计学差异（P＜0.01）。表达HBX的细胞caspase3活性下降，特异性shRNA抑制HBX表达后caspase3活性可再次增高。As2O3作用使HepG2和HepG2-pCEP4-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但显著抑制p53相对活性，shRNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。结论1．成功构建不同筛选特性的两个HBX基因真核表达载体。2．成功构建两个不同筛选特性的表达HBX基因的HepG2-X细胞模型。3．特异性的shRNA能抑制HepG2-pCEP4-X的HBX基因表达。4．2.0umol／L As2O3作用HepG2细胞36小时后可诱导细胞凋亡，并使细胞阻滞于G2／M期，但该作用是否与caspase3活性相关需进一步研究。5．As2O3作用后，HepG2-pCEP4-X细胞的细胞凋亡比和caspase 3活性均比HepG2细胞低，shRNA抑制HBX表达后则可使统计学差异消失，但这种效应与细胞周期无关。6．As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。7．HBX表达可能上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但显著抑制p53的结合与转录调节活性，shRNA抑制HBX表达后则无此效应。