玉米大斑病菌HOg-MAPK级联途径中StHOG1基因的功能研究

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本课题组前期克隆了玉米大斑病菌HOG-MAPK级联途径中的MAPK基因,并命名为StHOG1。本研究利用农杆菌介导的转化技术,获得2株StHOG1基因的敲除突变体;进一步研究了该基因对病菌生长发育、致病力、高渗胁迫及杀真菌制剂敏感性的影响。研究结果不仅有助于阐明HOG-MAPK级联途径的功能,也为研发针对MAPK信号途径的新型杀菌剂提供理论依据。主要研究结果如下:  (1)以pBS-PUC及pPZP100载体为骨架,构建了玉米大斑病菌StHOG1基因敲除载体。利用农杆菌介导的转化技术,筛选得到2株草胺磷抗性转化子;通过BAR基因引物PCR、StHOG1特异引物PCR、RT-PCR和Southern blotting证实这2株转化子为StHOG1基因敲除突变体,分别命名为△StHOG1-1和△StHOG1-2。  (2)在PDA培养基中,玉米大斑病菌StHOG1基因敲除突变体菌落生长速率显著高于野生型菌株,突变体菌丝颜色较浅,气生菌丝疏松,不产生分生孢子,表明StHOG1基因负调控病菌的菌丝生长,正调控分生孢子发育。  (3)透射电镜观察发现,在正常培养条件下,野生型菌株基生菌丝表面附着大量絮状物质而StHOG1基因敲除突变体基生菌丝表面光滑;在高渗胁迫培养基中,野生型菌株基生菌丝细胞壁表面的絮状物质变得致密,2株突变体菌丝细胞壁表面的致密絮状物很少,说明StHOG1基因与絮状物质的产生密切相关;用细胞壁合成干扰物质Congo red、CFW、SDS处理后,突变体菌落生长抑制率明显低于野生型菌株,以上结果说明StHOG1基因参与调控病菌细胞壁的发育。  (4)在0.4M NaCI、0.4M KCl、0.6M山梨醇的高渗胁迫条件下,突变体对高渗胁迫更敏感,菌落生长受抑制程度高于野生型,尤其对山梨醇的反应;进一步研究发现,正常培养条件下两株突变体与野生型菌株的甘油含量没有明显差异,而在高渗胁迫条件下野生型菌丝细胞的甘油含量约为突变体的1.5倍,这表明高渗胁迫下StHOG1基因缺失减少了病菌菌丝中甘油的积累量,这可能是导致突变体对高渗胁迫更敏感的原因。  (5)在含有杀菌剂咯菌腈、异菌脲的PDA培养基中,StHOG1基因敲除突变体菌落生长受抑制程度明显低于野生型,表明StHOG1基因负调控病菌对杀菌剂(咯菌腈、异菌脲)的耐受性。
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