研究背景狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患性传染病,病死率几乎为百分之百。狂犬病在世界范围内广泛分布,我国是深受狂犬病严重危害的国家之一,仅次于印度,位居世界第二。自1950年我国开始有狂犬病的记录以来,出现了几次大的流行高峰,在20世纪80年代疫情最为严重,年报告病例曾达7037例,到1996年降到最低水平(196例),随后又开始迅速回升,2007年我国狂犬病病例又达到一个流行高峰(3300例),之后逐年缓慢下降,在2011年降到1918例,疫情依然较为严重。另外,除了传染病报告系统外,为进一步了解狂犬病暴露后预防处置及宿主动物情况,2005年中国疾病预防控制中心在全国6省建立了15个狂犬病主动监测点,收集死亡病例和门诊就诊病例的暴露后预防治疗信息、宿主动物监测信息,并利用主动监测信息深入探讨影响我国狂犬病疫情的相关因素。本研究利用2007-2011年全国狂犬病疫情相关资料探索5年疫情下降的可能原因,为进一步控制我国狂犬病流行提供科学依据。狂犬病核蛋白(N)基因是狂犬病基因组中最保守的,其广泛用于狂犬病的狂犬病分子诊断及病毒感染检测实验中,也被用作病毒长时间进化研究的对象来分析狂犬病的地域特征、病毒起源、宿主转换等时空进化的研究中。随着分子研究的深入,核酸检测技术越来越成熟,对狂犬病N基因的分子流行病学研究也越来越多。以往对N基因的研究多局限于我国某个或某几个省份的标本,时间跨度也不大,本文收集全国14个省份2003年到2011年的狂犬病阳性标本,对标本的核蛋白基因序列进行分子流行病学分析,并结合近年来全国狂犬病疫情变化情况,探讨了全国狂犬病的分布、变迁、变异情况,为进一步有效控制我国狂犬病的传播和蔓延提供有利的科学依据。研究目的1.描述2007-2011年全国狂犬病流行状况,以了解全国狂犬病疫情分布的总体特征。2.以主动监测点的监测数据资料探讨个案病例及门诊病例暴露后预防治疗及宿主动物防控与流行的内在联系。3.探讨狂犬病N基因遗传变异特点和进化特征,分析狂犬病病毒N基因在时间上进化中是否有变异及变异的大小。4.对狂犬病病毒N基因序列进行空间动力学分析,从种系发生进化上探讨狂犬病的迁徙传播路径,为进一步控制狂犬病的传播蔓延提供科学依据。研究方法1.狂犬病疫情资料的整理和分析(1)利用中国疾病预防控制中心“传染病疾病监测信息报告管理系统”中2007-2011年全国上报的狂犬病疫情资料描述狂犬病流行的三间分布。(2)对2007-2010年全国设立在山东、广西、贵州、安徽、湖南、江苏、贵州6省的15个监测点主动上报的资料做描述性分析,比较4年来死亡病例的暴露后预防治疗情况,犬密度及免疫率的变化情况,探讨这些变化与疫情变化的内在关系。(3)具体个案用Epidata3.0软件录入,用Excel2007、SAS9.0进行统计分析,用Excel2007进行图表的绘制,用Maplnfo7.0进行地图的绘制。2.狂犬病标本的实验室检测及N基因全序列的获得本研究收集了来自全国14个省市的动物(犬、牛)脑组织标本,以及人的血、唾液、脑脊液标本,利用直接免疫荧光(DFA)和巢式PCR法对标本进行抗原及核酸检测,确认阳性标本后进行N基因扩增和序列测定。3.N基因全序分析(1) ATCG软件对测序回来的序列(.abl格式的)进行拼接。(2) BioEdit软件对拼接好的长短不一的序列进行剪切、删除编辑、比对,对不同格式的序列进行格式的转换。(3) Clustalx(1.83)对拼接好的序列进行比对,可将比对好的序列转化成其他格式的以便其他软件继续分析。(4) DNAStar(5.01版)软件包中的MegAlign软件进行核酸和氨基酸同源性分析。(5) GeneDoc软件将比对好的核酸和氨基酸序列按照位置一一逐行显示。(6) MEGA(5.1版)软件对整理好的序列进行分子进化遗传分析,分别用软件中的Neighbor-Joining(NJ)、Maximum Likelihood(ML)法方法绘制种系发生树。(7) MigaPhyla软件以不带分支长度的无根树文件为基础,进行迁徙事件分析以及间隙事件显著性分析。结果1.2007-2011年间我国狂犬病发病数逐年下降,但报告病例的县(区)数分别为984、858、892、817、862个,下降不明显,其中个别省份报告病例的县区数还有增多趋势。广西、广东、贵州、湖南、四川报告病例数明显下降但仍是我国报告病例最多的省份,其疫情影响着周边省市及全国疫情趋势。我国狂犬病发病夏秋季节较多；男女发病比为2.32：1；农民(68.27%)、学生(12.47%)、散居儿童(6.32%)为高发人群,农民所占比例在逐年升高,学生所占比例逐年降低,散居儿童变化不大。2.2007-2010年主动监测省市共报告2346例死亡病例,88.53%的致伤动物为犬,111度暴露比例为56.97%,但门诊处置率却只有11.36%,疫苗注射率为12.08%,被动免疫制剂的使用只有4.60%,且四年间比较差异没有明显的改善。狂犬病门诊监测显示暴露人群11Ⅲ度暴露比例为36.11%,门诊处置率为85.43%,狂犬病疫苗全程接种率为82.13%,Ⅲ度暴露后被动免疫制剂的注射率为30.30%。我国农村部分地区犬只密度自2008年以来有所减少,免疫率有所提高。3.本研究自全国14个省共得到了116条狂犬病1353bp的N基因全序。116条狂犬病病毒N基因序列核苷酸同源性在87.0%-100%之间,核苷酸推到的氨基酸同源性在97.6%-100%之间,说明N基因的突变大多是同义突变。4.N蛋白的四个抗原位点中,个别序列抗原位点Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ有变异,B细胞、Th细胞表位及磷酸化位点也有变异,本研究所有序列均存在三个Asn196、Asn326、Ash443潜在的糖基化位点。5.本研究所得序列形成了3个群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),进化树显示我国狂犬病病毒呈现地域聚集性,13个省市的序列分布在Ⅰ群,6个省市的序列分布在Ⅱ,Ⅲ群只包括内蒙古的一株序列。全国24个省市的狂犬病系统进化树显示NM3与我国福建、吉林株进化较近,时间进化显示N基因没有明显的进化差异。全球狂犬病树图显示所选序列基因1型中共分为7个支,大部分聚集在Ⅰ、Ⅱ支,我国狂犬病与印度尼西亚、越南等东南亚国家进化关系最近,NM3与伊朗、外蒙古的3株在同一支上,说明其亲缘关系较近。6.从空间动力学角度上我国狂犬病存在广泛的跨省传播的现象,本研究显示我国狂犬病由四川省、广西等南方高发省份向东部地区和北方地区传播的可能性较大。结论1.2007-2011年我国狂犬病报告病例数有所下降,但流行区域有所扩大。2.部分地区调查数据显示犬只密度有所下降、犬免疫率有所上升,从而在一定程度上减少了人间狂犬病的传染来源。3.死亡病例暴露后预防处置率低的现况说明暴露后预防治疗的不及时、不规范是狂犬病死亡病例发病的主要原因；农村地区犬密度高但免疫率低、暴露后预防治疗欠缺的状况仍然是农村地区狂犬病持续发生的重要原因。4.狂犬病病毒N基因序列差异较小,非常保守,与其功能的限制密切相关。狂犬病N基因相对保守,本研究所得的N基因序列同源性较高,变异大多为同义突变。5.本研究所有的病毒序列都属于狂犬病病毒基因1型,进化树显示出明显的地域依赖性聚集特点。我国与东南亚地区狂犬病进化关系最近,内蒙分离的病毒与外蒙古、伊朗分离毒株的进化关系较近。我国狂犬病病毒在独自进化的同时可能也经历着外界传入病毒的影响。6.从空间动力学角度上分析我国狂犬病存在广泛的地域间的传播扩散,从高发省份向低发省份传播蔓延。