现代医学研究表明,蛹虫草含有虫草素、腺苷、多糖、虫草酸、麦角甾醇等多种活性物质,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、提高免疫力等功效,并因其具有相似的活性成分而成为传统名贵中药材——冬虫夏草的良好替代品。蛹虫草已经实现了规模化人工栽培,以解决冬虫夏草产品的市场供应不足问题。但蛹虫草菌株在继代培养过程中经常会出现严重的菌株退化现象,影响了子实体的发育,造成蛹虫草的规模化生产的损失。本研究以生产用蛹虫草菌株YCCZ为母株,接种于大米培养基继代培养蛹虫草菌株六代(命名:YCCZ1-6),观察各世代蛹虫草子实体的发育,研究其交配型基因的表达差异,分析判定菌株退化时期,比较研究退化前后蛹虫草菌株活性物质含量的变化,通过转录组测序分析研究这六代蛹虫草菌株间可变剪接、差异表达基因以及GO(Gene ontology)通路和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路的变化,以期探讨蛹虫草菌株的退化机制。具体研究结果如下:一、蛹虫草菌株的继代培养和退化分析通过继代培养得到的6代蛹虫草菌株,子实体发育情况表明,第1代和第2代菌株子实体长势一致,色泽橙黄,生长状况良好;第3代菌株子实体颜色变淡,部分子实体末梢膨大;第4代菌株子实体矮小且细;第5代和第6代菌株则不能成功发育出子实体;说明蛹虫草菌株从第3代开始出现退化现象。蛹虫草菌株的交配型是判定菌株是否退化的重要指标之一。我们提取了6代蛹虫草菌株的基因组DNA,Touch-down PCR方法检测了菌株的交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1的表达,结果表明蛹虫草菌株从第5代开始缺失了MAT1-1-2基因。综合分析,蛹虫草菌株在第3代与第4代之间开始退化,而交配型基因的改变导致菌株不能正常发育子实体。二、不同世代蛹虫草菌株菌丝体活性物质含量的变化菌株退化直接影响子实体的发育,也可能影响菌丝体内活性物质的含量。蛹虫草多糖、麦角甾醇、虫草素/腺苷、虫草酸等活性物质的含量是衡量蛹虫草品质的重要指标,通过HPLC和比色法分析了六代蛹虫草菌株中这4种活性物质含量的变化。实验结果显示,第1-3代,随着传代次数的增加,多糖含量逐渐增加,第3代菌株多糖含量达到峰值54.55 mg/g,但第4代菌株多糖含量骤然下降至23.93 mg/g,且第5-6代菌株多糖含量维持在第4代的低水平;麦角甾醇含量与传代次数呈负相关,第1代菌株麦角甾醇含量达到8.02 mg/g,但从第3代开始显著下降至0.77 mg/g;菌丝体中虫草素/腺苷含量随着传代次数的增加呈下降趋势,至第6代虫草素下降了97.96%,而腺苷下降了88.29%;虫草酸含量变化不明显,基本维持在1.2 mg/g左右。结果说明,蛹虫草多糖、麦角甾醇和虫草素/腺苷含量的与其子实体的发育呈显著的负相关性。三、不同世代蛹虫草菌株转录组的比较分析为进一步阐释蛹虫草菌株退化的分子机制,我们分别提取了6代继代培养蛹虫草菌株的总RNA,并进行高通量转录组测序分析。转录组共检测出9,015条已知序列,并预测了731个新基因;6个菌株中共检测到35323个可变剪接(AS),且多发生在第2、4和6代中;相比于第1代菌株,第2代、第3代、第4代、第5代和第6代菌株的DEGs差异表达基因数(Differential expression of genes)分别为1892、2498、2006、2273和2188个,其中第3代菌株的DEG数目最多,包含1729个上调基因和769个下调基因。通过GO分析和KEGG分析,并通过Real time PCR验证,筛选鉴定出51个与菌株退化相关的基因,分别参与毒素生物合成、能量代谢、DNA甲基化和染色体重构等生命活动。