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目的:本研究通过检测不育男性少弱精组和正常男性精液组抗氧化基因NRF2启动子上游408bp-994bp区共24个甲基化位点的甲基化状态,探讨DNA甲基化修饰与不育男性少弱精症患者之间的关系,从而从表观遗传学角度为不育男性少弱精症的临床诊断治疗提供理论基础。 方法:收集临床精液样本进行精液常规分析。蛋白酶K-酚氯仿法提取精子基因组DNA并行重亚硫酸盐修饰;设计与精子DNA抗氧化基因NRF2上游特定待检测的片段(NRF2启动子上游408bp-994bp区间)相匹配的引物进行PCR扩增,回收DNA片段并进行分子克隆;最后行菌液PCR鉴定阳性克隆并挑选15-20个阳性克隆菌液送测序,用DNA-MAN软件对测序结果进行序列分析并统计分析结果。 结果: 1.不育男性少弱精症患者精子畸形率显著比对照组高,少弱精组畸形精子指数TZI平均为为1.5,精子畸形指数SDI为1.4,其中头部缺陷数占97.9%±2.6%,尾部缺陷数占14%±9.3%,不育男性少弱精症组各项形态学指标均高于对照组。 2.不育男性少弱精症组精子顶体酶活性(39.90±4.85)μIU/106精子比对照组(82.15±33.11)μIU/106精子显著下降,这与精子头部形态学的改变相一致。 3.两组精液提取的精子DNA OD260/OD280值均介于1.7~1.9之间,表明所提取的精子DNA纯度较好,无蛋白质及RNA污染。 4.不育男性少、弱精组和正常精液组抗氧化基因NRF2启动子上游408bp-994bp共24个甲基化位点共获得1431个正确克隆,最终统计分析发现99%以上的CpG位点呈非甲基化状态,单纯少精组患者其第7个甲基化位点缺失率为24.6%,单纯弱精组患者其第7个甲基化位点缺失率为26.3%,少、弱精组第7个甲基化位点缺失率为25%,少(和或)弱精组第7个甲基化位点缺失率明显比对照组18.14%高。 结论: 1.正常生育男性及不育男性少、弱精患者抗氧化基因 NRF2启动子上游408bp~994bp区均呈现非甲基化状态。 2.精子抗氧化基因NRF2启动子上游408bp~994bp位置处第7个甲基化位点缺失可能与精子成熟障碍有关。