论文部分内容阅读
目的：利用毕赤酵母高效表达耐辐射奇球菌PprI蛋白，对pxxx/YYY毕赤酵母重组工程菌株诱导表达，并对PprI蛋白的诱导表达、纯化和发酵条件进行研究，并建立相应的表达、纯化和发酵技术路线，获得大量的PprI蛋白，为进一步研究PprI蛋白的作用机理及生物效应提供实验资料。材料与方法：构建毕赤酵母重组表达质粒pxxx-His-pprI，将鉴定正确的重组质粒pxxx6×His-pprI经Sal I酶切线性化，电转化毕赤酵母YYY感受态细胞并进行筛选，挑取经鉴定为阳性的pxxx-6×His pprI毕赤酵母转化子进行培养，加入甲醇至终浓度为1%进行诱导表达。SDS-PAGE电泳，Western blotting，质谱鉴定目的蛋白。采用离子交换、SFF(Ni)镍鳌合亲和层析、凝胶层析过滤和咪唑洗脱进行蛋白纯化，SDS-PAGE电泳检测。采用Bradford法进行His-PprI蛋白质浓度测定。外源蛋白表达条件，诱导时间、补加甲醇浓度、溶氧、发酵液pH值等方面逐个进行实验优化。用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量，以蛋白含量高低及蛋白电泳条带明暗为优化标准，以标准品的浓度与相应的OD值做出标准曲线，计算待测蛋白样品的浓度。结果：DNA测序结果表明合成的耐辐射奇球菌pprI基因编码序列正确，毕赤酵母转化菌株的培养上清液中经SDS-PAGE、Western blotting和质谱检测证实PprI蛋白成功在毕赤酵母YYY中表达。实验结果显示在甲醇至终浓度0.8-1.2%，温度28-30℃，PH5.5-6.5时蛋白表达量最高为28-32g/L。用离子交换、SFF(Ni)镍鳌合亲和层析、凝胶层析过滤和咪唑洗脱进行蛋白纯化，经SDS-PAGE电泳、Western blot和质谱检测证实为PprI蛋白，相对分子质量为43KD，蛋白量为0.35mg/mL，bradford法检测浓度为95%。结论：1．成功构建了耐辐射奇球菌PprI蛋白的毕赤酵母分泌表达工程菌株，并建立了其相应的表达技术路线2．本研究成功的优化诱导PprI蛋白高效表达条件，并建立了相应的技术路线。3．本研究成功探讨了PprI蛋白的分离纯化条件及鉴定方法，并建立了相应的技术路线。以上工作为进一步研究PprI蛋白抗放作用和生物学效应奠定了坚实的基础。