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泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system ,UPS)是细胞内蛋白质降解的主要非溶酶体通路,是通过多聚泛素化链而降解的。UPS在调节细胞程序方面起重要作用,包括细胞周期调控、免疫反应、凋亡、信号转导、正常和病理条件下蛋白质的转换、修复损伤、氧化和错误折叠的蛋白质等。通过泛素蛋白酶体通路进行蛋白质的降解包括两个步骤:1)多个泛素分子与酶底物共价结合;2)通过26S蛋白酶复合体标记的蛋白质的降解,游离的泛素再利用。这个过程由泛素循环酶所介导,其中包括泛素活化酶(Ubiquitin activating enzyme)E1、泛素结合酶(Ubiquitin conjugating enzyme)E2、泛素-蛋白质连接酶(Ubiquitin-protein ligase)E3。在该途径中,泛素连接酶E3负责蛋白质泛素化的特异性,识别靶蛋白底物,并在引发通过26S蛋白酶体识别靶蛋白及随后的蛋白质降解中起关键作用。Smad泛素化调节因子2(Smad ubiquitin regulatory factor2,Smurf2)是E3泛素蛋白质连接酶家族的成员,在调节transforming growth factor-β(TGF-β)-Smads信号通路中起关键的作用,它主要通过泛素依赖的途径降解Smad2和Smad7等。过量表达TGF-β在肾纤维化进展中起致病作用,肾小管间质纤维化程度与肾功能恶化密切相关,且比肾小球硬化更能预测预后。本文拟研究Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在肾间质纤维化损伤中的作用,及其在Smads介导的TGF-β信号通路中的作用和抑制性Smad7的调节机制,并观察了甘草酸( glycyrrhizin acid,GA)对其的影响及可能途径。首先以Wistar大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)为模型,在不同的时间点(7 d、14 d、21d、28 d)观察梗阻侧肾间质炎性细胞浸润指数、纤维化指数及Smurf2的变化。结果发现:随着梗阻时间的延长,肾间质炎性细胞浸润指数、纤维化指数逐渐加重,Smurf2mRNA和蛋白、Smad2mRNA和蛋白逐渐上调;TGF-β1mRNA在UUO后第七天达高峰,此后逐渐下降,但仍明显高于假手术组;Smurf2mRNA和蛋白质与UUO大鼠肾间质纤维化指数呈正相关,与Smad2mRNA和蛋白呈正相关。从而得出: Smurf2核酸和蛋白质在输尿管梗阻大鼠肾组织中出现了明显表达增强,它可能通过介导TGF-β/Smads通路的活化,使Smad7的降解增加,Smad2的降解减少,而参与了肾间质纤维化的发生发展。另外研究体外条件下TGF-β1(5ng/ml)诱导人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)表达Smurf2、Smad7、Ⅳ型胶原的情况,以及MG132对其的影响。可以得出结论:在体外,TGF-β1可诱导HK-2细胞Smurf2mRNA和蛋白、Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达上调、下调Smad7mRNA和蛋白的表达;泛素蛋白酶体抑制剂MG132可抑制Smurf2mRNA和蛋白的表达、并抑制Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达,部分恢复Smad7mRNA和蛋白的表达。因此可以说MG132是一种潜在的抗肾纤维化的药物。为了研究中药甘草酸对输尿管梗阻大鼠肾间质中Smurf2的作用及TGF-β/Smad通路在其中的作用。我们以Wistar大鼠制作UUO模型,在不同的时间点(7 d、14 d、28 d)观察梗阻侧肾间质纤维化指数、TGF-β1的表达情况;肾皮质中与肾脏纤维化相关的Smurf2、Smad7、Smad2信号蛋白及纤维连接蛋白(FN)等的表达。结果发现:随着梗阻时间的延长,肾间质纤维化程度逐渐加重,Smurf2基因和蛋白质表达明显上调,TGF-β1、Smad2、FN蛋白呈时间依赖性上调;Smad7蛋白呈时间依赖性下调,Smad7 mRNA在各个时间点无明显变化;甘草酸能改善UUO所致的肾间质纤维化程度,下调肾脏组织TGF-β1的表达,减少Smurf2基因和蛋白质的表达,下调肾脏组织TGF-β1、Smad2、FN蛋白的表达,同时上调TGF-β1信号传导中抑制性因子Smad7蛋白的表达。由以上结果可以得出:在UUO大鼠中,Smurf2(作为一种可以降解Smad7的泛素连接酶E3)高表达和Smad7低表达在肾小管间质纤维化中发挥重要作用,甘草酸能保护UUO所致的肾间质纤维化损伤,其作用机制可能是通过抑制TGF-β/Smads通路的激活,减少Smurf2的表达,增加抗纤维化作用的Smad7蛋白表达,阻止TGF-β信号传导,减少肾间质FN的沉积,减轻细胞外基质的沉积,从而减轻肾小管间质纤维化的发生发展。第一部分泛素连接酶Smurf2在输尿管梗阻大鼠肾间质损伤中的作用目的探讨Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在输尿管梗阻大鼠肾间质损伤中的作用。方法以Wistar大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)为模型,在不同的时间点(7 d、14 d、21d、28 d)观察梗阻侧肾间质炎性细胞浸润指数、纤维化指数的变化;采用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)观察UUO大鼠不同阶段肾组织中与肾脏纤维化相关的因子Smurf2mRNA、Smad2mRNA、转化生长因子β1(TGF-β1) mRNA表达水平的改变及其之间的相关关系。应用Western印迹检测Smurf2蛋白、Smad2蛋白表达及其之间的相关关系。结果①随着梗阻时间的延长,肾间质炎性细胞浸润指数、纤维化指数逐渐加重,Smurf2mRNA和蛋白、Smad2mRNA和蛋白逐渐上调(P<0.01);TGF-β1mRNA在UUO后第七天达高峰,此后逐渐下降,但仍明显高于假手术组(P<0.01)。②Smurf2mRNA和蛋白质与UUO大鼠肾间质纤维化指数呈正相关(r=0.911,P <0.O1;r=0.964, P <0.O1),与肾间质炎性细胞浸润指数无相关关系,与Smad2mRNA和蛋白呈正相关(r=0.975,P<0.01;r=0.979,P<0.01)。结论Smurf2基因和蛋白质在输尿管梗阻大鼠肾组织中出现了表达明显增强,它可能通过介导TGF-β/Smads通路的活化而参与了肾间质纤维化的形成。第二部分TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞Smurf2的表达及MG132对其的影响目的探讨体外条件下转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)表达Smurf2、Smad7、Ⅳ型胶原的情况,以及泛素蛋白酶体阻断剂MG132对其的影响。方法应用RT-PCR法检测Smurf2mRNA、Smad7mRNA和Ⅳ型胶原mRNA的表达,应用Western印迹检测Smurf2蛋白、Smad7蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达。结果(1)HK-2细胞有基础量的Smurf2 mRNA和蛋白、Smad7 mRNA和蛋白、Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达;5ng/ml的TGF-β1能够上调HK-2细胞Smurf2mRNA和蛋白的表达,与正常对照组相比,分别上升了57.4%、75.56%(P<0.01);并能上调Ⅳ型胶原mRNA和蛋白表达,分别上升了46.4%、97.95%(P<0.01);下调Smad7 mRNA和蛋白的表达,分别下降了43%、62.03%(P<0.01)。(2)泛素蛋白酶体抑制剂MG132(2.5umol/L)能抑制TGF-β1(5ng/ml)所诱导的HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达,与TGF-β1刺激组相比,分别下降了42.9%、50.28%(P<0.01);并抑制Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达,分别下降了38.7%、51.33%(P<0.01);能部分恢复Smad7mRNA和蛋白的表达,分别上升了73.3%、3.128倍(P<0.01)。结论在体外,TGF-β1可诱导HK-2细胞Smurf2mRNA和蛋白、Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达上调、下调Smad7mRNA和蛋白的表达;泛素蛋白酶体抑制剂MG132可逆转上述作用;MG132可能具有抗肾纤维化作用,可能是通过抑制TGF-β/Smads通路的激活,从而减轻细胞外基质的沉积而实现的。第三部分甘草酸对输尿管梗阻大鼠肾间质中Smurf2的作用目的探讨甘草酸对肾间质纤维化的作用及可能机制。方法以Wistar大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)为模型,在不同的时间点(7 d、14 d、28 d)观察梗阻侧肾间质纤维化指数;致纤维化的转化生长因β1(TGF-β1 )的表达情况;肾皮质中与肾脏纤维化相关的Smurf2、Smad2、Smad7信号蛋白及纤维连接蛋白FN的mRNA及/或蛋白质的表达。结果①随着梗阻时间的延长,肾间质纤维化程度逐渐加重,Smurf2基因和蛋白质明显上调,呈时间依赖性(P<0.01);Smad7、FN蛋白呈时间依赖性下调(P<0.01),Smad7基因在各个时间点无明显变化;TGF-β1基因在UUO后第七天达高峰,此后逐渐下降,但仍然高于假手术组(P<0.01)。②甘草酸能减轻UUO所致的肾间质纤维化程度(P<0.01),下调肾脏组织TGF-β1的表达(P<0.01);减少Smurf2基因和蛋白质、Smad2和FN蛋白质的表达,同时上调TGF-β信号传导中抑制性因子Smad7蛋白质的表达(P<0.01)。结论甘草酸能保护UUO所致的肾间质纤维化损伤。其可能的作用机制为减少Smurf2核酸和蛋白质的表达,增加抗纤维化作用的Smad7蛋白表达;减少TGF-β1及Smad2表达,阻止TGF-β信号传导,减少肾间质FN的沉积,从而阻断肾间质的纤维化。