研究背景胆管癌主要起源于分化的胆管上皮细胞,部分也可起源于未分化的肝干细胞,是仅次于肝细胞癌的肝胆恶性肿瘤。过去几年的流行病学数据显示,全世界胆管癌的发生率和致死率呈上升趋势,对于这种疾病发生发展的机制目前尚不明确。由于解剖学部位特殊,早期胆管癌不易发现,一旦发现多数已处于晚期阶段。传统的化学疗法和放射疗法对晚期胆管癌的治疗效果有限,无法有效延长患者的生存期,因此鉴定新的胆管癌调控信号通路并据此筛选新的分子靶向药物已经迫在眉睫。Neddylation修饰是最近报道的一种新型类泛素化蛋白翻译后修饰,它通过一系列的酶促反应将类泛素小分子NEDD8连接到靶蛋白上,进而调控靶蛋白的生物学功能。CRL(Cullin RING Ligase,CRL)泛素连接酶是目前鉴定最为明确的neddylation底物,它的活化需要在其核心组成亚基Cullin发生neddylation修饰。CRL作为最大的胞内多亚基泛素连接酶,可以调节大约20%的经泛素-蛋白酶体途径降解的蛋白。MLN4924作为特异性的neddylation通路抑制剂,可以有效的阻断cullin neddylation,抑制CRL泛素连接酶的功能,具有显著的抗肿瘤效果,目前已经进入多种肿瘤的I期临床试验阶段。为阐明neddylation通路在胆管癌发生发展中的潜在作用和靶向该通路进行胆管癌治疗的可行性,本研究确定了neddylation通路在胆管癌中的活化状态,阐明了neddylation通路特异性抑制剂MLN4924抗胆管癌的作用与机制,为进一步开发neddylation通路抑制剂(如MLN4924)作为机制清晰的胆管癌分子靶向新药提供科学依据。研究方法本实验首先通过肿瘤组织芯片技术,全面系统的在胆管癌组织样本中鉴定neddylation通路的活化情况。具体内容包括：(1)确定代表整体neddylation水平的NEDD8蛋白、催化neddylation修饰的E1酶NAE蛋白和E2酶UBC12蛋白的表达情况；分析neddylation通路活化情况与患者预后等病理参数的相关性；进而鉴定neddylation通路在胆管癌细胞系和胆管癌原代细胞株中的活化情况。(2)研究neddylation抑制剂MLN4924对胆管癌细胞的生长抑制作用及其机制。具体内容包括：确定MLN4924对胆管癌细胞增殖的抑制作用、诱导胆管癌细胞死亡的分子机制以及对裸鼠胆管癌皮下模型的抗肿瘤治疗效果评价。研究结果(一) Neddylation通路在胆管癌组织中高度活化并且与患者手术后复发密切相关通过免疫组织化学染色方法对胆管癌肿瘤组织芯片进行染色,鉴定NEDD8、 NAE、UBC12等neddylation通路关键蛋白在胆管癌组织样本中的表达情况。结果发现与正常胆管组织相比,胆管癌组织中代表整体neddylation水平的NEDD8蛋白在68.9%(222/322)的病例中表达上调；NEDD8活化酶NAE的两个亚基NAE1和UBA3分别在70.5%(227/322)和67.1%(216/322)的病例中表达上调；NEDD8结合酶UBC12在72.0%(232/322)的病例中表达上调。这些数据表明整体neddylation通路在胆管癌组织中高度活化。运用统计学方法分析胆管癌组织neddylation通路各指标染色结果与临床病理资料,我们发现neddylation通路关键蛋白NEDD8、NAE、UBC12在胆管癌中表达呈正相关,并且其高表达与患者手术后复发密切相关。(二) Neddylation小分子抑制剂MLN4924体外抗胆管癌效果与机制(1) Neddylation通路在胆管癌原代细胞和细胞系中均高度活化免疫印迹实验检测胆管癌细胞系和四株胆管癌原代细胞株中neddylation通路活化情况。结果发现neddylation通路关键蛋白NEDD8、NAE1、UBA3、UBC12在胆管癌细胞系和原代细胞株中都有表达。(2)MLN4924体外抑制胆管癌细胞增殖细胞增殖分析发现,MLN4924处理人胆管癌细胞系QBC939和RBE显著抑制细胞增殖活力(P<0.05)。细胞克隆形成分析发现,MLN4924也可显著地抑制胆管癌细胞克隆形成能力(P<0.05)。以上结果表明,MLN4924可以显著地抑制胆管癌细胞的生长。(3)MLN4924诱导胆管癌细胞发生G2期细胞周期阻滞和DNA损伤应答对细胞周期进行分析发现,MLN4924诱导2株胆管癌细胞发生G2/M期细胞周期阻滞；免疫印迹进一步检测发现,上述2株胆管癌细胞中的Cullin的neddylation修饰受到抑制,1)CRL底物p21、p27、Weel等细胞周期抑制蛋白的降解均因受到抑制而明显积聚,M期标志性蛋白p-H3表达下降；2)CRL底物DNA复制调控蛋白CDT1和ORC1明显积聚,DNA损伤应答标志蛋白p-H2AX表达明显增多。以上结果表明,MLN4924通过抑制上述2株胆管癌细胞CRL泛素连接酶活性,导致其底物降解受阻而发生积聚,从而诱导胆管癌细胞DNA重复复制,引起DNA损伤应答反应,诱导胆管癌细胞发生G2期细胞周期阻滞。(4)MLN4924诱导胆管癌细胞发生细胞凋亡或细胞衰老通过对胆管癌细胞进行形态学观察、细胞周期中Sub-G1期细胞所占比例分析、细胞凋亡相关蛋白剪切的caspase-3和PARP表达含量分析,以及细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色分析, 我们发现MLN4924诱导QBC939细胞发生细胞凋亡,诱导RBE细胞发生细胞衰老,表明MLN4924诱导胆管癌细胞死亡方式具有有细胞系特异性。(三)MLN4924体内抑制胆管癌肿瘤生长利用RBE细胞接种制备裸鼠皮下肿瘤模型,并予以MLN4924药物治疗,我们发现MLN4924药物处理显著抑制胆管癌肿瘤生长。而且,治疗过程中未出现明显的不良反应,具有高度的安全性。以上结果表明,MLN4924对胆管癌肿瘤的生长具有显著的抑制作用。结论Neddylation蛋白翻译后修饰通路在胆管癌中高度活化,靶向neddylation通路进行抗肿瘤治疗具有良好抗胆管癌效果。机制上,neddylation通路抑制剂MLN4924通过灭活其CRL泛素连接酶发挥体内外抗肿瘤活性。本研究发现鉴定了neddylation通路作为新型抗胆管癌分子靶点,为进一步开发其抑制剂MLN4924作为新型胆管癌分子靶向药物提供了科学依据。