慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是造血干细胞恶性克隆增殖性疾病,占血液系统肿瘤的15%-20%,发病率为1-2/10万。约有95%的CML患者存在Ph染色体,即9号染色体c-abl癌基因易位到22号染色体的bcr基因处,形成bcr-abl融合基因,bcr-abl融合基因编码BCR-ABL融合蛋白,该蛋白具有异常活跃的酪氨酸激酶活性,激活Ras/Raf/MEK/ERK,PI3K/AKT,JAK-STAT等通路,促进细胞增殖和存活,抑制细胞凋亡,导致CML的发生和发展。Imatinibmesylate（STI571,Gleevec or Glivec,Novartis）是BCR-ABL酪氨酸激酶活性抑制剂,对Ph⁺的CML患者具有良好的疗效,并于2001年获美国FDA批准成为治疗CML的一线药物。然而,随着imatinib在临床的广泛应用,发现有相当一部分患者出现耐药。CML对imatinib耐药的机制涉及到很多方面,包括BCR-ABL点突变或bcr-abl在基因水平、mRNA水平、蛋白水平扩增,多药耐药基因（multi-drugresistance gene,mdr-1）mRNA和其蛋白产物P-glyco-protein（Pgp）过表达,克隆演变,新的染色体异常出现,LYN激酶的过表达等。克服imatinib耐药是当前血液界在CML治疗中关注的焦点。已有研究表明法尼基抑制剂SCH66326和lonafamib,Src/ABL家族酪氨酸激酶抑制剂dasatinib和bosutinib,高三尖杉酯碱对部分imatinib耐药的白血病患者有效。其他药物还有蛋白酶体抑制剂Velcade,DNA甲基化抑制剂地西他滨decitabine等单用或联合imatinib可以治疗部分耐药的患者。尽管这些药物和其他的新药可以治疗耐药的患者,但是由于副作用或费用昂贵等原因限制了它们的应用。所以,迫切地需要研究新的低毒高效的治疗CML的药物。小檗胺（berbamine）,是从中草药小檗属植物三颗针中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱,被广泛用于治疗各种原因尤其是肿瘤化疗引起的白细胞减少症已数十年。我们课题组以往的研究显示小檗胺可以抑制白血病细胞的增殖和诱导凋亡,包括K562细胞,Jurkat细胞,NB4细胞,而且对正常人的骨髓细胞无明显副作用。但是关于小檗胺对耐药的K562细胞作用研究甚少。本研究以多药耐药CML细胞株K562-resistant（K562-r）细胞为研究对象,研究小檗胺在对耐药的CML细胞的体内外作用,探讨其可能的作用机制及小檗胺应用于CML治疗的可行性。第一部分:小檗胺对耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株K562-r细胞增殖和凋亡的影响目的:检测小檗胺对耐药的人慢性粒细胞白血病K562-r细胞增殖和凋亡的影响。方法:MTT法检测小檗胺,imatinib,或两药联合对K562-r细胞的抗增殖作用。Wright-Giemsa染色、Hoechst33258染色观察K562-r细胞的形态学变化,琼脂糖凝胶电泳分析小檗胺作用后K562-r细胞DNA有无出现梯型条带,流式细胞仪进行细胞凋亡检测。RT-PCR扩增和测序的方法检测BCR-ABL激酶区序列。RT-PCR和Westernblot方法检测bcr-abl和mdr-1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达,以及凋亡相关蛋白PARP的表达。结果:小檗胺对K562-r细胞具有增殖抑制作用,这种作用呈浓度-时间依赖关系。24h和48h的IC₅₀分别为12.9μg/ml和8.4μg/ml。小檗胺能增强K562-r细胞对imatinib的敏感性,使得K562-r细胞对imatinib的IC₅₀从2.23μM降低到0.35μM。小檗胺能诱导K562-r细胞凋亡,经16μg/ml小檗胺作用后K562-r细胞出现典型的凋亡细胞的特征性改变,DNA琼脂糖凝胶电泳观察到典型的梯型条带,流式细胞仪细胞DNA含量测定显示小檗胺作用K562-R后sub-G₁期细胞增加,并随着作用时间的延长而明显增加,Annexin V/PI荧光双染分析结果也显示凋亡细胞百分比随着小檗胺作用时间的延长而增高。并且发现小檗胺能下调bcr-abl基因在蛋白和mRNA水平的表达,明显降低磷酸化BCR-ABL（phospho-BCR-ABL,pBCR-ABL）蛋白的表达,同时也能下调mdr-1基因在蛋白（P-gp）和mRNA水平的表达,另外经小檗胺作用后的K562-r细胞PARP出现剪切片段。测序结果提示本实验采用的K562-r细胞在BCR-ABL激酶区无点突变。结论:本研究结果提示小檗胺对K562-r细胞具有增殖抑制和诱导细胞凋亡的作用,并能增加耐药细胞对imatinib的敏感性;小檗胺对K562-r细胞的作用与下调K562-r细胞bcr-abl融合基因和mdr-1基因在蛋白水平和mRNA水平的表达有关;本实验采用的K562-r细胞BCR-ABL激酶区未发现突变存在,此耐药细胞对imatinib耐药与BCR-ABL激酶区突变无关。第二部分:小檗胺对K562-r细胞肿瘤信号通路影响的研究目的:探讨小檗胺对K562-r细胞增殖抑制和诱导凋亡所涉及的信号通路。方法:用肿瘤信号转导芯片（HS-044）,包括MAPK通路,Wnt通路,STAT通路,应激通路（p53通路及p38/JNK通路）,survival/NF-κB通路与PI3K/AKT通路等信号通路共128个位点,检测16μg/ml小檗胺处理前后肿瘤相关信号分子表达的差异,然后采用Westernblot方法进行验证芯片结果,并检测了与该分子相关的信号通路的其他伴随分子。结果:芯片结果显示经16μg/ml小檗胺处理K562-r细胞前后分子表达差异主要涉及的是Bcl-2信号通路、炎症/NF-κB信号通路、PI3K、MAPK等通路的有关分子。Westernblot结果显示:（1）小檗胺对抗凋亡Bcl-2亚家族信号通路的影响:小檗胺下调K562-r细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x_L,上调促凋亡蛋白Bax的表达和胞浆细胞色素C的水平。（2）小檗胺对NF-κB信号通路的影响:小檗胺对K562-r细胞总NF-κB表达水平无影响,但能明显下调细胞核内的NF-κB水平,虽然IκBα无变化,但phospho-IκBα（p IκBα）和IKKα和Survivin水平明显降低。（3）小檗胺对PI3K信号通路的影响:小檗胺作用6h后,可见PI3K/p110亚单位的表达量明显下调,但PI3K/p85、AKT、phospho-AKT（pAKT）的表达在药物处理早期变化不明显,在24h出现表达量下降。（4）小檗胺对MAPK通路的影响:小檗胺处理后可见ERK1/2、JNK和phospho-JNK（pJNK）也有明显下调。结论:小檗胺通过多种信号途径诱导K562-r细胞的凋亡,涉及Bcl-2蛋白家族、NF-κB信号通路,也与PI3K和MAPK信号通路的部分分子有关,但是谁是小檗胺诱导K562-r细胞凋亡的关键分子,则有待进一步研究。第三部分:小檗胺对耐药的人慢性粒细胞白血病细胞的体内作用的研究目的:研究小檗胺在耐药的人慢性粒细胞白血病细胞荷瘤小鼠体内的抗白血病作用方法:实验BALB/C nu/nu裸鼠24只,分两批进行,每批12只,接种5×10⁷K562-r细胞于裸鼠背部皮下,24h后将动物随机分为对照组和小檗胺给药组,每组各6只。小檗胺60mg/kg,ⅳ,一天两次,对照组给予等体积生理盐水,连续给药3周。观察小檗胺抗肿瘤增殖的效果和毒副作用,主要指标包括成瘤率、瘤体大小、瘤体重量及小檗胺对裸鼠外周血白细胞、肝、脾毒性作用。结果:小檗胺在BALB/C nu/nu荷瘤K562-r鼠体内具有抑制肿瘤生长的作用,对照组成瘤率为100%（12/12）,小檗胺组成瘤率为66%（8/12）。给药组瘤体积和瘤重量明显小于对照组,与对照组相比抑瘤率为60.43%。两组间外周血白细胞计数无明显差别,病理学检查也未发现小檗胺对肝、脾组织的损伤。结论:小檗胺在耐药的人慢性粒细胞白血病细胞荷瘤小鼠体内具有抗白血病细胞增殖作用,且未见明显的毒副作用,小檗胺有望成为治疗耐药CML患者的药物之一。