研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜组织炎症为特征的慢性疾病。治疗的主要目的是控制疼痛和炎症,减少关节损伤和残疾,维持或改善身体机能和生活质量。现代医学的药物治疗多针对单一靶点的调控,然而越来越多的治疗策略倾向于药物的联合使用。相比较于单靶标治疗策略,中医药复方所采取的多靶标的治疗策略显示出一定优势,在类风湿关节炎的治疗中发挥了重要作用。中医药治疗类风湿关节炎历史悠久,疗效显著。在“因地制宜”“辨证论治”理念的指导下,我们拟出了断藤益母汤这一临床使用有效的复方。前期的研究中,已经研究益母草碱、山奈酚、雷公藤甲素等单体成分的作用。然而,用单体成分代表复方整体疗效受到很多学者质疑,因此基于网络药理学的整体机制研究有一定意义。网络药理学已被广泛用于药物设计和发现,这一方法的使用基于这样一种假说,即许多有效药物通过调节多种靶点而非单一靶点发挥作用。系统生物学的进展揭示了与多靶点药物相比,高选择性化合物可能表现出低于预期的临床疗效。因此基于网络药理学的药物发现似乎有巨大的发展潜力。随着计算机技术和医学信息学的发展,分子对接不仅在药物筛选方面已经成为一种强大的工具和必不可少的技术,用于预测配体与蛋白质受体或酶结合时的可能性。在大多数情况下,研究者可以选择结合亲和力最优的配体和受体作为进一步生物化学实验和研究的对象。中药中含有大量有效活性成分。然而,如何确定中药中有效成分发挥作用的机制成为中医药作用机制研究不可避免的难题。MAP3K2(MEKK2)属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶激酶基因家族,参与调节多种MAPK信号通路,而MAPK信号通路对下游炎症反应有重要的调控作用。研究显示类风湿关节炎和骨关节炎滑膜组织中MEKK2的表达升高。在前期的研究中,我们已发现断藤益母汤对MAPK信号通路有调控作用,然而尚不清楚断藤益母汤能否对MAPK上游激活因子起到调控作用。一、基于网络药理学的断藤益母汤对类风湿关节炎的作用机制研究目的:1.断藤益母汤成分虚拟筛选2.断藤益母汤靶点预测3.类风湿关节炎靶点收集4.成分-靶点-通路网络构建及机制分析方法:将断藤益母汤中所含中药在TCMSP、TCMID及CNKI中进行检索。收集复方所含有的所有成分,然后根据药物ADME参数(吸收、分布、代谢、排泄)进行筛选。筛选结果为断藤益母汤潜在的活性成分。将筛选出的化合物在TCMSP数据库和HIT数据库中检索成分的潜在靶标。合并两个数据库中的结果,并去除重复靶点,以上结果即为断藤益母汤潜在靶点。在Drugbank数据库及TTD数据库中输入“rheumatoid arthritis”作为关键词,检索RA相关的靶点信息。合并两个数据库结果,去除重复项,得到类风湿关节炎相关靶点。将断藤益母汤靶点和类风湿关节炎靶点进行映射后取交集,得到断藤益母汤可能治疗类风湿关节炎的靶点。对共有靶点进行信号通路分析、蛋白-蛋白相互作用分析,构建成分-蛋白-信号通路网络图,进行可视化分析。结果:研究发现断藤益母汤中有四氢小檗碱、槲皮素、山奈酚等14个成分具有较好的ADME属性。14个成分可以靶向类风湿关节炎相关的42个靶点。这42个靶点参与多条信号通路,包括IL-17信号通路,TNF信号通路,Thl7细胞分化信号通路,NF-κB信号通路,破骨细胞分化等。结论:断藤益母汤可能通过多成分-多靶点-多通路的方式在类风湿关节炎中发挥治疗作用。其可作用的靶点主要与炎症反应相关或细胞凋亡相关。可能作用的信号通路涉及炎症反应和骨代谢。因此,断藤益母汤在类风湿关节炎中可能主要发挥抗炎活性。二、基于分子对接的断藤益母汤对MAP3K2的作用机制研究目的:1.断藤益母汤中潜在配体筛选。2.断藤益母汤与MAP3K2受体结合能力评估。方法:通过前期网络药理学的研究,从断藤益母汤中筛选出可以用于治疗类风湿关节炎的中药成分共14种。从TCMSP数据库下载单体的MOL2格式文件。在PyMoL数据库中转换为PDB格式。在AutoDock1.5.6程序中载入单体PDB格式文件,选择检测和可旋转root,保存为PDBQT格式,用于三维结构晶体网格的构建,以及配体和受体的对接。以上为配体的准备。利用PDB数据库寻找MEKK2(MAP3K2)三维晶体结构文件,以PDB格式保存三维结构。利用PyMOL软件对靶蛋白进行预处理,去除水分子,以及一些非活性位点的小分子,如甘油、锌、镁等。以上为受体文件的准备。将PDB格式受体三维晶体结构导入POCASA系统,导出受体蛋白活性口袋三维结构图。采用半柔性对接方法,将受体MEKK2与配体所有的可旋转键进行对接。根据AutoDock Vina评分函数计算出自由结合能排名前10的配体-受体复合物自由结合能,对构象进行评价。结果:MAP3K2蛋白表面共有3个活性口袋;断藤益母汤中,除槲皮素、樟脑苷、异鼠李素不直接MAP3K2活性口袋结合外,其他11个配体均可全部或大部结合于MAP3K2活性口袋。结论:DTYMD可能可以通过1 1个配体与MAP3K2直接结合于活性口袋而发挥作用。三、断藤益母汤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAP3K2表达的影响目的:1.研究断藤益母汤对MAP3K2蛋白及mRNA表达的影响。2.研究断藤益母汤对炎症因子表达的影响。方法:收集符合ACR1987年RA诊断标准的患者膝关节置换手术后的滑膜组织,采用组织块培养法培养成纤维样滑膜细胞。用不同浓度的断藤益母汤预处理细胞后,采用MTT法检测断藤益母汤对RA FLSs细胞生存率的影响;采用蛋白印迹法检测断藤益母汤对MAP3K2蛋白的影响;采用RT-qPCR法检测断藤益母汤对MAP3K2 mRNA的影响;采用ELISA法检测断藤益母汤对IL-6、TNF-cα、MMP-1的影响。结果:滑膜组织组织块培养5-7 d可见细长梭形细胞从组织块边缘移行出,呈放射状分布。断藤益母汤以浓度依赖方式抑制RA FLSs的活力,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。RT-qPCR检测结果显示,在炎症因子IL-1β刺激条件下,MAP3K2 mRNA表达水平显著升高,经过不同浓度断藤益母汤和MTX干预后,其表达水平相对于模型组均显著降低(P<0.05或P<0.01)。蛋白印迹分析发现与模型组相比,断藤益母汤高剂量、中剂量组对MAP3K2蛋白的表达有抑制作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA法检测结果显示不同浓度断藤益母汤和MTX干预后,MMP-1、IL-6、TNF-α表达显著降低(P<0.001)。结论:断藤益母汤可以下调类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAP3K2蛋白及mRNA的表达,对炎症因子MMP-1、IL-6、TNF-α也有下调作用。四、断藤益母汤对CIA小鼠模型关节炎的治疗作用目的:观察断藤益母汤对CIA小鼠关节炎模型的治疗作用。方法:42只SPF级DBA/1雄性小鼠,8周龄,分为模型组,断藤益母汤(高、中、低剂量)组,甲氨蝶呤组(MTX)。以正常小鼠作为正常组,以MTX为阳性对照组。每组样本量为7只。使用胶原诱导关节炎模型,即CIA小鼠模型。实验各组在RA小鼠模型第二次免疫时即在造模第21天开始给予相应的处理。正常组、模型组予腹腔注射生理盐水0.1ml/kg/d,断藤益母汤低/中/高剂量组灌胃量分别为6.25g/kg、12.5g/kg、25g/kg,MTX给药量为2mg/kg。每周灌胃2次,连续灌胃4周。每2天观察检测小鼠一般情况,称体重并进行小鼠关节炎评分。小鼠取材后计算小鼠脾指数、踝关节采用HE染色观察其病理变化。结果:与正常组比较,其他各组体质量下降有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中高剂量组小鼠体质量大于其他组,但没有统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组小鼠脾指数有升高(P<0.01)。与模型组比较,断藤益母汤低剂量组脾指数有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。首次免疫后3-5天后,部分造模小鼠双侧踝关节开始出现关节红肿,加强免疫后大部分小鼠发病,严重者出现关节活动受限。而断藤益母汤高剂量组、中剂量组、MTX组踝关节红肿不明显,关节炎评分较模型组低(P<0.05)。结论:断藤益母汤可以减轻CIA小鼠模型的关节炎肿胀度,对维持小鼠体重、脾指数有一定作用。