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副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）为一种嗜盐性弧菌，能导致人类食物中毒和旅游者腹泻，还能导致反应性关节炎、心脏疾病等。而临床上检测到的致病茵大多具有溶血现象（亦称神奈川现象），基因水平研究发现该类病原体都携带tdh基因，编码TDH。本研究应用基因工程技术克隆了tdh基因，并让其在原核表达载体pTrc99A上、经IPTG诱导得到高效表达，获得重组抗原，制备抗-TDH抗体；突变了TDH的Trp65→Ala65，期望构建出针对TDH的基因工程疫苗候选株。 设计一对引物，采用PCR技术扩增tdh基因，用限制性内切酶消化tdh、pUC19和pTrc99A，连接并转化宿主菌JM109，筛选并鉴定出重组质粒tdh/pUC19，由军事医学科学院完成序列测定。再亚克隆至pTrc99A上，构建出重组质粒tdh/pTrc99A。发酵重组菌tdh/pTrc99A/JM109，条件优化后，tdh基因在pTrc99A上，经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明tdh基因得到高效、可溶、非融合性表达；溶血试验证明该表达产物具有溶血活性。表达产物经超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换层析得到纯化。将tdh/pTrc99A/JM109作为抗原，经0.4％甲醛灭活，腹腔免疫大白兔，免疫程序为第1天、第5天、第9天、第11天和第15天，免疫剂量分别为12亿、12亿、18亿、18亿、18亿。末次免疫后第7天试血，效果满意后放血。兔血清经宿主菌JM109吸附，溶血抑制试验提示兔血清含有抑制VP溶血活性的物质。 设计一个诱变引物，与扩增tdh基因的上游引物，构成一对诱变引物，采用寡核苷酸定点突变的方法，定点突变编码TDH的第65位氨基酸的核苷酸残基（由野生型的Trp残基突变为Ala残基），通过基因工程技术，构建出Ala65的重组质粒tdhm/pUC19（tdh mutation），由中山医科大学达安基因诊断中心完成序列测定。再亚克隆至PTrc99上，构建出重组质粒tdhm/pTrc99A。发酵重组菌tdhm/pTrc99A/JM109，条件优化后，tdhm基因在pTrc99A上、经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明tdhm基因也得到高效、可溶、非融合表达。测试溶血毒力，发现 突变体的溶血毒力小于野生株。