背景:心血管疾病是人类健康的第一杀手,随着经济社会的发展和人口老龄化,我国心血管疾病的患病率持续增加,心肌梗死的发生率也日益升高。心肌梗死常常危及生命,尽早有效地恢复缺血心肌血液供应,是阻止缺血性心肌损伤的发展、减小梗死面积进而改善临床预后的根本措施。然而,缺血心肌恢复血液灌注后产生的再灌注损伤往往难以避免。除此之外,再灌注损伤也常常存在于器官移植、体外循环、休克复苏等情况中。近年来,尽管在缺血/再灌注损伤的防治和机制研究中已经取得了很大的进展,但如何有效的预防和减轻缺血/再灌注损伤仍然是临床工作者们面临的重要难题。有研究表明氧化应激和线粒体功能障碍在缺血/再灌注损伤中发挥了重要作用。线粒体DNA易受到氧化应激损伤。但缺血/再灌注损伤与线粒体DNA之间的关系尚不明确。番茄红素是一种脂溶性的抗氧化剂,属于类胡萝卜素中的一种,富含于番茄及其它各种红色蔬菜和水果之中,常温下呈红褐色长针状晶体。最近有研究表明番茄红素可以保护线粒体DNA使其免于氧化损伤。前期研究发现番茄红素能够减轻缺氧/复氧引起的心肌细胞凋亡。本研究旨在探讨线粒体DNA损伤在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其可能的机制,以及番茄红素能否通过保护线粒体DNA减轻心肌缺血/再灌注损伤,同时我们对番茄红素保护线粒体DNA的机制也进行了探讨。方法:1.大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型:结扎心脏冠状动脉左前降支,30 min后打开结扎部位让心肌重新获得血液灌注并持续24 h。H9c2细胞缺血/再灌注损伤的体外模型:将H9c2细胞缺氧6 h,复氧12 h。为了验证缺血/再灌注能够引起线粒体DNA的损伤,通过免疫荧光的方法来检测心肌组织及H9c2细胞中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),并通过COX IV抗体来识别心肌组织中的线粒体,通过线粒体的红色荧光探针Mitotracker Red来标定H9c2细胞中的线粒体,观察8-OHd G是否与线粒体重合。同时,通过实时荧光定量PCR来检测心肌组织及H9c2细胞中线粒体DNA拷贝数及线粒体DNA基因转录水平的变化。2.为了明确在上述缺血/再灌注动物模型和细胞模型中是否存在线粒体功能障碍,通过试剂盒对心肌组织及h9c2细胞中的atp进行检测。同时,还通过荧光探针jc-1对h9c2细胞线粒体膜电位进行检测。3.为了明确线粒体dna损伤本身是否能够导致线粒体功能障碍,用低浓度的溴化乙锭处理h9c2细胞来耗竭细胞中的线粒体dna,然后对h9c2细胞的线粒体膜电位,细胞中的atp水平以及细胞存活率进行检测。同时,对h9c2细胞中线粒体dna拷贝数及线粒体dna基因转录水平也进行了检测。4.为了明确番茄红素是否能够通过保护线粒体dna来减轻大鼠心肌的缺血/再灌注损伤。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)染色的方法来测定大鼠心肌缺血/再灌注后心脏的梗死面积。收集大鼠血浆,检测肌钙蛋白、乳酸脱氢酶以及肌酸激酶等心肌损伤生物标记物。通过tunel染色检测心肌组织及h9c2细胞中凋亡细胞的比率。通过免疫印迹法检测水解的caspase-3蛋白的表达量。对h9c2细胞进行annexinv及pi共染色,然后经流式细胞仪分析其中凋亡细胞的比率。同时,为了明确番茄红素对线粒体dna以及线粒体功能的保护作用,也检测了心肌组织及h9c2细胞中8-ohdg的含量,线粒体dna拷贝数,线粒体dna基因转录水平,线粒体膜电位以及细胞中atp水平。5.为了探讨番茄红素减轻线粒体dna损伤的机制,对心肌组织及h9c2细胞中的mda,ros以及线粒体内超氧化物含量进行了检测。同时,为了进一步明确番茄红素保护线粒体dna的作用是否与减轻氧化应激有关,在细胞实验中通过h2o2处理h9c2细胞,造成线粒体dna的氧化损伤,观察番茄红素对h2o2引起的线粒体dna损伤及线粒体功能障碍是否具有保护作用。6.为了进一步探讨番茄红素减轻线粒体dna损伤的机制,我们还通过免疫印迹和免疫荧光染色的方法对线粒体转录因子(调节线粒体dna拷贝、转录以及维持核样结构的关键蛋白因子)进行了检测。结果:1.在缺血/再灌注的动物实验和细胞实验中都发现,缺血/再灌注导致了8-ohdg的大量生成,且大部分与线粒体重合。pcr的结果提示线粒体dna拷贝数和基因转录水平均明显降低。这些结果表明心肌的缺血/再灌注损伤与线粒体dna损伤有关。2.动物实验和细胞实验都证实,缺血/再灌注导致细胞内atp水平明显降低。细胞实验证明,缺血/再灌注后h9c2细胞线粒体膜电位明显降低。这些结果表明缺血/再灌注引起了细胞线粒体功能障碍。3.为了明确线粒体dna损伤与线粒体功能障碍的关系,在细胞实验中通过向h9c2细胞加入低浓度的溴化乙锭的方法耗竭线粒体中的DNA,观察其对线粒体功能及细胞存活的影响。结果发现,加入溴化乙锭后细胞中线粒体DNA的拷贝数和基因转录水平随着时间的推移逐渐降低,同时也观察到细胞中ATP的水平及线粒体膜电位也逐渐降低,而线粒体中超氧物阴离子的浓度却逐渐增加,细胞活力逐渐下降。这些结果表明线粒体DNA损伤可以导致线粒体功能障碍,细胞死亡。4.番茄红素预处理能使大鼠心肌缺血/再灌注后的心脏梗死面积明显减少,使血浆中的心肌损伤标记物水平降低。在细胞实验中番茄红素能明显抑制缺氧/复氧导致的细胞死亡。在动物实验和细胞实验中都证明,番茄红素能使Tunel阳性的细胞数减少,使激活的caspase-3蛋白的表达量降低,使Annexin V染色阳性的细胞比率降低,表明番茄红素能够抑制缺血/再灌注引起的细胞凋亡。同时,在动物实验和细胞实验中都发现番茄红素能够有效的防止缺血/再灌注引起的8-OHdG的生成以及线粒体DNA拷贝数与线粒体DNA基因转录水平的下降。番茄红素还防止了缺血/再灌注引起的ATP水平的降低和线粒体膜电位的下降。这些结果表明番茄红素可以通过保护线粒体DNA,减轻线粒体功能障碍,抑制细胞凋亡,来减轻大鼠心肌的缺血/再灌注损伤。5.线粒体DNA特别容易受到氧化应激损伤。番茄红素能够明显抑制缺血/再灌注引起的MDA以及活性氧的生成。番茄红素也能够抑制H2O2引起的线粒体DNA损伤及线粒体功能障碍。6.通过对与线粒体DNA的拷贝、转录以及维持核样结构密切相关的关键蛋白因子Tfam的检测,发现缺血/再灌注以后线粒体中Tfam的表达量明显降低,而番茄红素能有效的抑制线粒体中Tfam的下降。结论:本实验研究结果表明:线粒体DNA损伤在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中发挥了重要的作用;番茄红素可通过保护线粒体DNA减轻大鼠心肌的缺血/再灌注损伤,其保护线粒体DNA的作用可能与其减轻线粒体氧化应激以及稳定线粒体中的Tfam有关。