甘草多糖的结构分析及免疫调节作用研究

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本文主要以传统中药甘草切片为原料,研究甘草多糖的提取工艺,甘草多糖的特性结构分析以及其对实验用小鼠免疫能力的调节作用。首先,在实验原料的选择上,通过对常见的几种甘草原料中,主要活性成分甘草酸和甘草多糖的含有量的比较,确定人工种植3~5年生甘草根小侧枝部位切片甘草酸含量为2.9%,多糖含量达5.0%,为最佳原料,用于本文的后续研究。在提取工艺研究中,通过单因素、正交实验研究,以分析纯葡萄糖为参照,以苯酚硫酸法测定多糖含量,确定最佳提取工艺为90℃水浴,30倍料/液比,0.5 h,提取两次。在甘草多糖的纯化过程中,用正交实验方法确定醇沉工艺,为80%乙醇,常温,12 h。通过比较选择使多糖组分损失较少的Sevage法,脱除甘草多糖粗提物中的蛋白质杂质。脱蛋白后的甘草多糖经冻干,所得样品为不含小分子杂质和游离蛋白杂质的甘草多糖(为指代清晰,后文称甘草原多糖)。将甘草原多糖溶于生理盐水,配制成一定浓度的口服溶液,对BalB/C小鼠进行灌胃,研究其体内免疫调节作用。主要选取碳粒廓清实验、淋巴细胞转化实验和血清溶血素实验。结果表明,甘草原多糖在适宜的剂量水平可以显著(P<0.01)提高小鼠的非特异性免疫和特异性免疫能力。将甘草原多糖复溶于蒸馏水,可溶性多糖经DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶层析柱分级分离,得到GPS-1b、GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a。将GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a用于特性结构分析和活性研究。通过红外光谱分析,确定其具有多糖特征结构;苯酚硫酸法测定总糖含量(以分析纯葡萄糖计)分别为87.8%,86.8%和82.3%,考马斯亮兰法测定其中结合蛋白含量分别为1.88%,7.54%和9.89%;气相色谱法研究其单糖组成,三种多糖均含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖;β-消去实验发现糖链与结合蛋白存在-O-的连接方式。原子力显微镜观察GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的微观形态,发现存在明显不同,分别呈现平面网状,立体网状和大小不均一的分散的聚集体形态。在对GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a的体外免疫活性研究中发现,GPS-4a在淋巴细胞转化实验中表现出高于其它两种的活化淋巴细胞的能力;而在NK-细胞杀伤实验中,GPS-2a、GPS-3a和GPS-4a均对NK-细胞对靶细胞的杀伤能力有所增强,但GPS-3a的效果略低于其他两者,这与其结构和微观形态上的差异存在不可分割的关系。
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