肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是重症或致死性手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）的主要病原体,能够入侵中枢神经系统（Central nervous system,CNS）,造成永久性的损伤。目前,临床上的主要治疗方法为对症治疗及静脉注射免疫球蛋白,尚无针对EV71感染可用的抗病毒药物。因此,开发安全有效的EV71的抗病毒药物具有重要意义。Retro-2^cycl是通过细胞高通量筛选（High-throughput screening,HTS）的方法得到的蛋白毒素抑制剂,对多种病原体的抑制活性相继被报道。Retro-2^cycl通过靶向阻断细胞囊泡运输（Intracellular vesicle transport）而对利用这一过程的病原体发挥抑制作用。细胞囊泡运输参与了EV71生命周期中包括非裂解性释放（Non-lytic release）的数个重要过程,为Retro-2^cycl以及其活性衍生物Retro-2.1作为EV71潜在的抗病毒药物的研究提供了可行性。因此,本论文对Retro-2^cycl及Retro-2.1对EV71的抗病毒作用进行了研究。黄酮类化合物（Flavonoids）是一类具有相同母核的小分子化合物,有多种生物活性。其中,数种黄酮类化合物对EV71的抗病毒活性已经被相继报道。然而,这些报道来自于不同研究体系,限制了化合物间横向比较的可能性;此外,这些报道仅限于细胞水平的研究,而动物模型的有效性是验证药物发展潜力的重要指标。因此,本论文对代表性黄酮类化合物对EV71的抗病毒活性进行了研究。单纯性疱疹病毒2型（Herpes simplex virus type 2,HSV-2）是引起生殖器疱疹的主要病原体,并具有终身潜伏性;HSV-2还能够增加感染人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）以及罹患宫颈癌的风险。临床上的主要治疗方法为基于阿昔洛韦（Acyclovir）或其前药的化学疗法;然而,耐药性以及严重的毒副作用限制了阿昔洛韦的使用。目前,在研的化合物多数由于毒副作用而被迫停止研究。因此,开发安全有效的替代性HSV-2的抗病毒化合物迫在眉睫。ABMA是通过细胞高通量筛选（High-throughput screening,HTS）的方法得到的另一类蛋白毒素抑制剂,并对多种病原体具有抑制活性。ABMA通过靶向宿主细胞内吞转运（Host-endosomal trafficking）而发挥抑制作用,而细胞内吞转运属于细胞囊泡运输（Intracellular vesicle transport）的范畴,参与了HSV-2生命周期中包括内吞进入（Endocytic entry）及包膜包封（Envelopment）的数个重要过程,为ABMA作为HSV-2潜在的抗病毒药物的研究提供了可行性。因此,本论文对ABMA对HSV-2的抗病毒作用进行了研究。本研究分为以下三个部分:第一部分:Retro-2^cycl和Retro-2.1对EV71的抗病毒作用研究首先,我们建立了EV71的293S细胞感染模型,基于此模型通过细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）及病毒空斑（Plaque formation）效应实验,得到Retro-2^cycl和Retro-2.1的选择性指数分别为:>39.81和5356。随后,我们通过检测不同的给药方式对抑制活性的影响,发现Retro-2^cycl及Retro-2.1的有效作用阶段为EV71生命周期的晚期阶段,可能阻断了子代病毒的包装或释放;在EV71子代病毒包装及释放阶段（5–16 h）给药,发现细胞外病毒滴度降低,而细胞内病毒滴度升高,证明Retro-2^cycl及Retro-2.1是通过阻断子代病毒的释放而发挥作用的;此外,还在细胞免疫荧光实验中发现,Retro-2^cycl和Retro-2.1将EV71由细胞膜下的累积转变为细胞质中的均匀分布,直观地验证了该抑制作用。最后,我们建立了EV71的BALB/c乳鼠致死感染模型,对Retro-2^cycl对EV71的体内抗病毒效果进行评价(由于Retro-2.1的水溶性较低,仅对Retro-2^cycl进行了体内实验,提高Retro-2.1水溶性的优化正在进行中);发现Retro-2^cycl在10 mg/kg的剂量下,能够使致死剂量EV71感染的乳鼠的生存率提高至90%。综上所述,该部分研究证明了Retro-2^cycl及Retro-2.1为EV71的体内外有效制剂,并初步阐明了其作用机制:阻断细胞囊泡运输参与的子代病毒的释放;由于Retro-2^cycl的大量衍生物已经被报道,该部分研究可为EV71抗病毒药物的研究提供了先导化合物;由于Retro-2^cycl及Retro-2.1的作用靶点为细胞囊泡运输而非病毒本身,降低了产生耐药性的风险;由于Retro-2^cycl及Retro-2.1被报道对多种病原体均具有抑制作用,本部分研究进一步地扩大了病原体的范围,为Retro-2^cycl及Retro-2.1发展为广谱性药物提供了依据,并且提示:细胞囊泡运输可以作为有效的抗病毒靶点。第二部分:黄酮类化合物对EV71的抗病毒作用研究首先,我们对9种黄酮类化合物的体外活性进行检测,为动物实验的用药剂量提供参考;结果显示,9种化合物的选择性指数均高于4;其中,7-羟基黄酮的治疗指数为12215.79,具有最佳开发潜力。随后,我们选择适宜的剂量对化合物的体内抑制活性进行检测,发现9种化合物均对EV71的体内感染具有显著性的保护作用;其中,7-羟基黄酮在0.2 mg/kg的低剂量下可达到66.67%的保护率,异鼠李素在10 mg/kg的剂量下可达100%的保护率,具有最佳开发潜力。综上所述,该部分研究发现了异鼠李素对EV71的抗病毒作用;证明了9种黄酮类化合物的体内有效性;在同一体系中对9种黄酮类化合物对EV71的抗病毒活性进行研究,为化合物间的比较提供了依据;证明了7-羟基黄酮及异鼠李素为具有较大抗EV71潜力的黄酮类化合物。第三部分:ABMA对HSV-2的抗病毒作用研究首先,我们建立了HSV-2的Vero细胞感染模型,基于此模型通过细胞病变（Cytopathic effect,CPE）及病毒空斑（Plaque formation）效应实验,得到了ABMA的选择性指数为:20.93;并通过基于病毒水平的核酸及蛋白含量检测验证了其有效性。随后,我们通过检测不同的给药方式对抑制活性的影响,发现ABMA对HSV-2的有效作用阶段为生命周期的早期及晚期阶段;通过病毒的吸附与进入实验,发现ABMA作用于HSV-2早期阶段的进入过程,并在细胞免疫荧光实验中发现,ABMA将HSV-2由细胞核内及核周分布转变为细胞膜外分布,直观地证明了该抑制作用;此外,通过在HSV-2晚期阶段（6–18 h）给药,发现细胞内外病毒滴度均显著性地降低,而HSV-2的包装及释放发生在感染5 h之后,是在晚期阶段最有可能被抑制的过程。最后,我们建立了HSV-2的BALB/c雌鼠感染模型,对ABMA的体内抗病毒效果进行评价,ABMA在5 mg/kg的剂量下,使HSV-2生殖道攻毒后的小鼠存活率由8.33%提高至50%。综上所述,该部分研究证明了ABMA为HSV-2的体内外有效抑制剂,并初步阐明了其作用机制为:阻断细胞囊泡运输参与的HSV-2的进入过程及生命周期晚期过程,为HSV-2的抗病毒药物提供了先导化合物;由于ABMA的作用靶点为细胞囊泡运输过程,而非病毒本身,降低了产生耐药性的风险;由于ABMA对多种病原体均具有抑制活性,该部分研究进一步地扩大了病原体的范围,为ABMA发展为广谱性药物提供了依据,并提示:细胞囊泡运输可以作为有效的抗病毒靶点。