【摘 要】
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酸敏感离子通道（Acid-sensing ion channel,ASIC）是退化蛋白/上皮钠通道（Degenerin/Epithelial Sodium Channel,DEG/ENa C）超家族的亚家族之一,ASIC通道除了能被质子激活以外还能够被多种小分子配体,脂类分子,毒素多肽等激活,在生理病理上也发挥着重要的作用。近年来的研究报道,对于ASIC通道的结构的解析与激活机制的阐述也越来越透彻
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酸敏感离子通道（Acid-sensing ion channel,ASIC）是退化蛋白/上皮钠通道（Degenerin/Epithelial Sodium Channel,DEG/ENa C）超家族的亚家族之一,ASIC通道除了能被质子激活以外还能够被多种小分子配体,脂类分子,毒素多肽等激活,在生理病理上也发挥着重要的作用。近年来的研究报道,对于ASIC通道的结构的解析与激活机制的阐述也越来越透彻,但这主要针对胞外区域,由于跨膜域结构解析的精度（分辨率）限制以及胞内域部分截短而非全长的结构,使得对其门控尤其是脱敏过程的认识仍缺乏精确的信息。本文以鼠源ASIC3（r ASIC3）为研究对象,研究通道在脱敏过程中跨膜域发生的变化,寻找在这一过程中发挥作用的关键区域,并进一步挖掘和理解整个脱敏门控的作用机制。获得主要结果有:（1）化合物NBM和NPM能够作为研究ASIC脱敏的分子工具:全细胞记录实验中,结构相似的NBM和NPM能使ASIC3E79C通道产生不同的脱敏现象;单通道记录实验显示,两者诱导通道产生的单通道电导相似,两者均为～10 PS;前期研究中两化合物产生的通道脱敏差异与结合的分子数无关,且通道开放过程的离子选择性相似,故我们认为此二者能作为研究通道脱敏的分子工具。（2）以化合物NBM和NPM为工具分子,通过对位于跨膜域上下两端的残基进行突变筛选,确定了2对氨基酸R64…L437、A49…L456参与通道的脱敏,它们如同两个卡口将跨膜域的GAS-belt卡在了中间,可能调控着跨膜区上下两个开口在通道激活到脱敏这一过程中的动态变化。（3）使用ASIC3的激动剂p H 5.0,Ca2+-free和GMQ,以及调节剂SGI和AE848,对野生型通道跨膜域的关键氨基酸进行验证筛选,发现位于第一跨膜域（TM1）上端的第64位氨基酸（R64）的突变,能显著降低通道在脱敏过程中产生的持续电流;同时,R64附近的氨基酸突变也对通道脱敏有影响,这一结果与通过NBM和NPM工具分子筛选所获得的结果是一致的。说明R64位置的突变在通道脱敏门控中起至关重要的作用,它通过与其周边氨基酸之间的互作,使跨膜域在脱敏动力学过程中相互协调,维系脱敏门控的稳定和有序。综上所述,通过一系列的实验,发现R64突变在通道脱敏门控中起着重要作用,为寻找ASIC脱敏的内源性和外源性调控因子以及发现其生物学功能奠定了基础。同时为后续基于CRISPR/Cas展开的基因敲入相关位点的突变,展开关于ASIC通道快脱敏与慢脱敏介导的生物学功能研究提供精确的位点信息。
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