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禽流感病毒不仅严重危害养禽业,而且给公共卫生造成巨大威胁。1957年和1968年分别爆发了世界范围的流感病毒大流行:1957年亚洲流感是由禽流感病毒的HA、NA、PB1基因与人流感病毒5个基因片段重组产生的病毒引起的,1968年香港流感是由禽流感病毒的HA、PB1基因与人流感病毒6个基因重组产生的病毒引起的,因此,推测重组后加速了病毒变异,从而促进重组病毒更迅速地适应新宿主,造成流感大流行。为证明这一假设,本研究利用H9N2亚型禽流感病毒（A2093株）和WSN的反向遗传操作系统,用A2093的HA和NA基因与某一聚合酶或NP基因替换WSN的相应基因,获得了r2093HANAPB2/WSN、r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、r2093HANANP/WSN四种重组病毒。四种重组病毒及其亲本毒分别以MOI:0.001的剂量感染MDCK细胞,分别于感染后12h、24h、48h、72h收集细胞上清,利用蚀斑形成的方法进行病毒滴度的测定,绘制病毒生长动力学曲线。结果显示,感染细胞后24h,病毒滴度达到峰值;r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN的病毒滴度明显高于r2093HANAPB2/WSN和r2093HANANP/WSN。四种重组病毒及其亲本毒分别以105PFU经鼻腔感染小鼠,攻毒后第4天四株重组病毒在肺脏和鼻腔的滴度均介于亲本毒A2093和WSN之间,在肺脏中重组病毒的滴度均相似,但在鼻腔中r2093HANAPB1/WSN和r2093HANAPA/WSN的滴度明显高于r2093HANAPB2/WSN和r2093HANANP/WSN。这些结果表明,与禽流感病毒的不同聚合酶或NP基因重组产生的新病毒,其复制能力具有明显差别。为了进一步了解不同重组病毒在传代过程中的变异速率,以感染剂量MOI为0.001的病毒感染MDCK细胞后24h收取细胞上清液,如此连续传10代。对传代前、第五代和第十代病毒的HA、M、NS基因进行RT-PCR扩增和深度测序。结果显示HA基因上r2093HANAPB1/WSN、r2093HANAPA/WSN、A2093和WSN病毒的前五代相对平均变异速率分别为7.085×10-5、4.535×10-5、4.42×10-5、4.94×10-5,而前十代相对平均的变异速率分别为4.575×10-5、4.335×10-5、4.665×10-5、5.055×10-5;同样地,M基因与NS基因上前五代相对平均变异速率分别为7.58×10-5与6.245×10-5、5.965×10-5与5.515×10-5、7.235×10-5与4.285×10-5、8.46×10-5与5.295×10-5,而前十代相对平均的变异速率分别为6.23×10-5与4.8×10-5、5.415×10-5与4.655×10-5、6.425×10-5与3.715×10-5、7.02×10-5与4.935×10-5,前五代病毒的相对平均变异速率明显比前十代病毒相对平均变异速率高,说明病毒传代过程中前五代发生了更多的突变。为验证病毒在小鼠是否有相似的变化,将病毒在小鼠体内连续传代10代,取第五代和第十代肺脏研磨液提RNA,PCR扩增HA、M、NS基因,深度测序显示病毒的变异速率与细胞上的结果相一致,但HA基因发生较为剧烈的突变,对前五代r2093HANAPB1/WSN和WSN相对平均变异速率进行分析,结果显示二者的变异速率差异显著,说明病毒在小鼠体内更容易积累突变。本研究初步证明流感病毒重组影响病毒变异速率,加快了病毒变异。为了进一步了解不同重组病毒在传代过程中HA基因碱基的突变谱,统计所有腺嘌呤（A）突变到胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）或者鸟嘌呤（G）的比率,同理,所有T到A、C或者G、所有C到A、T或者G和所有G到A、T或者C的比率。结果显示在MDCK细胞和小鼠体内传代的各病毒发生A到G的突变比率都较高,而r2093HANAPB1/WSN在小鼠体内传五代的病毒A到C、C到A、G到T的比率明显高于WSN毒株（P<0.05）,这与r2093HANAPB1/WSN病毒在小鼠体内更容易积累突变相符。第十代病毒A2093碱基A突变到G、C到A、C到T、G到A的比率明显高于r2093HANAPB1/WSN毒株（P<0.05）。病毒在小鼠体内传代,适应宿主的能力各不相同,r2093HANAPB1/WSN病毒第五代就出现较多突变,而A2093病毒在第十代出现较多突变,表明PB1重组病毒能更容易发生突变来适应宿主。