结核病是危害人类和动物的重大传染病之一,尤其是近年来随着多重耐药分枝杆菌的出现以及与病毒的混合感染,使得对结核病的治疗变得越来越困难。因此,研究结核病的致病机理、研发新型高效的结核病疫苗已成为当务之急。结核分枝杆菌的分泌蛋白是引发疾病的重要毒素或逃避机体免疫系统的工具,尽管已经证明了结核分枝杆菌的几个分泌蛋白(Ag85b、ESAT-6等)为重要毒力因子,但该病原致病机理以及免疫逃避的分子机制尚不明确。本课题组的前期研究发现,结核分枝杆菌rv0394c基因的编码蛋白Rv0394c(SEC)含有跨膜区,预测SEC蛋白可能为一种分泌型蛋白,且rv0394c基因仅存在于致病性的分枝杆菌如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌中,因而可能与分枝杆菌致病性相关;SEC蛋白具有透明质酸酶和硫酸软骨素酶活性,其作用底物是构成细胞外基质的主要成分,属于糖胺聚糖类大分子物质,且透明质酸广泛存在于多种细胞表面,推测SEC蛋白可能在分枝杆菌粘附宿主细胞的过程中发挥重要作用。为了验证这一推测,我们开展了以下实验研究。本研究首先利用大肠杆菌表达系统获得了重组SEC蛋白,经亲和层析纯化后免疫小鼠,采用细胞融合、克隆和筛选等技术,制备了针对该蛋白的单克隆抗体,作为后续实验的检测工具;通过间接ELISA检测方法,证明了该蛋白具有与DNA和多糖等大分子物质的结合特性;通过激光共聚焦显微镜,直观地观察到SEC蛋白粘附人肺泡上皮细胞(A549)的现象。为进一步验证SEC蛋白与细胞的结合特性,我们将rv0394c基因克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV262中,构建了重组质粒pMV262-sec,电转化入耻垢分枝杆菌MC2155后获得了组成型表达rv0394c基因的重组菌MS/SEC;利用A549为细胞模型与重组菌MS/SEC进行互作,结果发现与亲本菌相比,重组菌MS/SEC粘附A549细胞的能力显著提高,而这种粘附作用可被SEC蛋白以及抗该蛋白的特异性抗体所阻断;以小鼠为动物模型,将重组菌经鼻腔感染小鼠,定期检测重组菌的定殖情况。结果表明,与亲本株相比,重组菌在小鼠肺部的定殖能力增强,且能造成肺部组织一定程度的病理变化,而加入外源透明质酸则可以促进重组菌的清除。此外,通过Western Blot方法检测SEC蛋白在分枝杆菌各亚细胞组分中的分布情况,结果表明,该蛋白主要存在于胞壁,为一种表面锚定蛋白,这也为证明其在分枝杆菌粘附细胞过程发挥作用提供了更充分的证据。综上所述,本研究首次制备了抗结核分枝杆菌SEC蛋白的单克隆抗体,为进一步研究结核分枝杆菌SEC蛋白的结构和功能提供了研究工具。通过细胞粘附试验,鉴定出结核分枝杆菌具有透明质酸酶活性的新粘附因子—SEC蛋白,实验结果表明其可能参与了分枝杆菌的致病过程。本研究的发现进一步丰富了我们对分枝杆菌致病机理的理解,也为深入探索透明质酸酶在结核分枝杆菌致病中的作用奠定了基础。