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CRKI是从白色念珠菌中克隆到的一个C刀CZ相关的蛋白激酶基因,它参与调控白色念珠菌菌丝生长,并对白色念珠菌的致病能力有重要影响。为研究它的作用机理,我们利用LexA酵母双杂交系统,把白色念珠菌染色体DNA用Sau3AI部分酶解并融合于LexA的激活结构域(AD),构建了AD融合的白色念珠菌基因组表达文库。文库含独立转化子7.7x1o“个,包含DNA总长度约为1.2x1O5 kb,约覆盖白色念珠菌基因组全长的10倍,是研究白色念珠菌信号转导途径的重要资源。我们把Crkl(l一748aa)与LexA的DNA结合区融合,作为诱饵筛选白色念珠菌基因组表达文库,在9x1O5个转化子中获得8个Leu、LacZ双阳性克隆,经酶切鉴定与序列分析其插入片段有3种,编号为瓦刀、瓦了2、瓦了3。经序列同源性比较,这些插入片段分别与酿酒酵母基因STll、尺石T2和刀2叮Z具有最高同源性。进一步用CrklN端的激酶活性区和C端非激酶区与这3种蛋白相互作用,结果表明:NJI与CrklN端激酶活性区相互作用较弱,而NJZ,NJ3与CrklC端非激酶区有很强的相互作用。这些蛋白质可能参与Crkl的成熟、转运、定位以及活性调控。我们进一步把crklN端半长蛋白(1一370aa),CrklC端半长蛋白(350一702 aa)分别与LexA的DNA结合区融合,筛选了白色念珠菌双杂交文库,获得了一些编码蛋白的基因片段。 在以Crkl的N端半长(含激酶结构域)为靶蛋白筛选双杂交文库时,我们获得了两种基因插入片断,编号为瓦力VZ与瓦力VZ。通过序列同源性比较,发现瓦力VZ与酿酒酵母基因c刀C37具有最高同源性,而瓦了刀2与酿酒酵母基因STll同源性最高。Cdc37蛋白普遍存在于各个物种,主要参与激酶的成熟及活力表现。为此,我们将筛选到的基因命名为CaCI〕C37。通过搜索白色念珠菌基因组序列,获得cacl〕c37的全长基因,其编码区全长1 524bp,编码一个508 I I<WP=3>中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文摘要个氨基酸的蛋白,分子量大约为58 kD,同源性比较发现其全长蛋白与酿酒酵母的Cdc37蛋白有近41%的同源性。在酿酒酵母中高表达CaCde37可以校正酿酒酵母cdc37突变株(cdc37-34)的温度敏感表型。我们通过双杂交系统和免疫共沉淀对CaCdc37与Crkl的相互作用进行验证,发现它与Crkl的激酶活性区和Crkl全长蛋白都有相互作用,而与Crkl的C端调控区则没有相互作用,说明它象其他Cdc37蛋白一样,专一识别激酶活性区。Northern杂交结果表明,它在白色念珠菌多个菌株中均稳定表达,不受MAPK,cAMp于KA途径的调控。通过研究Crkl在酿酒酵母中的表达情况发现CaCdc37影响Crkl蛋白的稳定性,校正了Crkl在cdc37缺陷株中的表达缺陷,证明CaCdc37参与帮助Crkl蛋白的成熟。我们进一步检测了cacdc37蛋白与另外一个HsP90辅助分子伴侣蛋白Castil的相互作用情况,发现CaCde37与Castil之间也存在相互作用。根据以上结果,我们提出了Crkl蛋白可能的成熟机制模型。 CRKl的N端半长蛋白与酿酒酵母的Burl和人的Cdkg具有较高的同源性,Burl和Cdkg已经被证实是CDK蛋白家族成员,并且都参与RNA聚合酶11的C末端重复区域的磷酸化。crkl缺失株的生长受6一氮尿营的抑制,也显示Crkl可能具有同样的功能。我们以体内体外生化手段初步分析了Crkl与RNA聚合酶n CTD的相互作用。同时,我们通过GFP融合的Crkl研究其在胞内的定位情况。 Cln3是酿酒酵母的Gl期周期蛋白,为了研究Cln3在细胞周期与形态发生中的作用,我们构建了酿酒酵母CLN3基因的缺失株,并对其表型进行了分析。结果显示,cln3缺失株对。信息素的敏感性增强,。信息素诱导的细胞周期停滞现象明显大于野生型菌株,这种增强作用不受Burl因子的影响。同时,与野生菌相比cln3缺失株的细胞形态也有明显变化,双倍体cln3缺失株细胞的顶端生长能力增强而单倍体细胞的侵入生长能力则受到抑制。结果表明,与酿酒酵母的另外两个Gl期周期蛋白Clnl,ClnZ不同,Cln3在形态发生中有其独特的功能与作用方式。