乙型脑炎(JE)是由黄病毒科黄病毒属中的一员乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种严重影响人和动物健康的蚊媒人畜共患疾病,JEV感染人后主要损害患者的中枢神经系统,部分幸存者会有严重的神经性后遗症。JEV能引起母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎等。圈养猪和水鸟都是JEV的储存与扩散宿主,都为JE病毒循环传播机制中的关键环节。洞庭湖特殊的湿地生态系统为多种水鸟和蚊虫提供优良的生长繁殖环境,此外洞庭湖区周边有20多个养猪大县,生猪养殖场规模较大、数量居多。因此,本研究对处于洞庭湖区的3个猪场进行乙型脑炎流行病学研究,了解在猪场环境中的蚊子以及猪群中JEV的感染情况,这对于研究此地区JEV分子生物流行病学,预防和控制当地JE具有一定的意义。采用RT-PCR扩增JEV的保守区3′UTR、Ⅰ和Ⅲ型JEV prM基因,结果蚊子的阳性检出率为42.9%(45/105),仔猪脑组织样品的阳性检出率为8.2%(10/123),公猪精液样品中未检测到JEV;对24头跟踪猪采血并进行JEV抗体检测、采集猪舍中的蚊子进行病原检测,结果表明:该批猪从4月至7月JEV抗体阳性率总体呈现先下降后升高的规律,阳性率先后为83.3%、66.7%、41.6%、25%、50%、91.6%;37份蚊子样品中,JEV检出率为43.2%(16/37),其中7月高达50%(7/14),表明在乙型脑炎流行季节,当仔猪JEV抗体下降最低时对JEV易感,受携带JEV的蚊子叮咬影响,导致本次跟踪后期猪只抗体升高。从阳性样品分离病毒,先后将JEV阳性研磨滤液接种至BHK21细胞离病毒,一共分离获得3株JEV,将新分离株命名为HNML1(蚊源)、HNML2(蚊源)、HNML3株(猪源)。3株JEV E基因核苷酸序列与疫苗株SA14-14-2株相应序列的同源性分别为86.9%、86.8%、86.9%,推导氨基酸同源性分别为97.0%、96.8%、97.0%,与SA14-14-2分别存在15、16、15个氨基酸的差异,包括8个与关键毒力相关的氨基酸。分析结果表明,JEV分离株都为基因I型的JEV。值得注意的是HMML3株与2002年在我国辽宁从人类身体分离到的LN02-102株同源性接近。将原核表达的HNML-1株EDⅢ蛋白经过纯化后两次免疫ICR小鼠,制备鼠抗EDⅢ蛋白免疫血清,Western Blotting试验说明该免疫血清与EDⅢ能够发生明显反应,间接免疫荧光(IFA)显示,免疫组血清与细胞内病毒发生反应,血清的中和抗体效价为1:44.6。通过ELISA、中和试验、Western Blotting验证了EDⅢ蛋白具有较好的免疫原性。基于EDⅢ蛋白建立了JEV(Ig G)间接ELISA方法,与IFA方法比较,符合率为93.4%。为更好确定未免疫JEV疫苗的猪群母源抗体消长规律以及感染抗体起始规律,以EDⅢ蛋白为诊断抗原初步建立JEV(IgM)抗体间接ELISA方法。在JE流行季节开始至结束采集汨罗地区两个种猪场6批仔猪、时间跨度近8个月跟踪血清共840份,应用本试验建立好的JEV(IgG、IgM)ELISA方法进行检测,结果体现出JE抗体消长与JE季节性流行规律相符合,可以用于JE的抗体检测。