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研究背景膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤。90%以上源自于移行上皮,初发病例中75%为表浅性肿瘤(pTis,pTa,pT1),25%在初诊时为侵润性肿瘤或者已发生远处转移。经尿道膀胱肿瘤电切(TURBT)辅以术后膀胱灌注化疗是现阶段治疗表浅性膀胱肿瘤的主要手段,但术后复发率可高达85%,一旦复发,其生物学行为也随之改变,往往向更高的病理分级及临床分期发展,超过20%的复发性肿瘤最终进展为侵润性癌。相对于表浅性肿瘤来说,侵润性病变治疗棘手,预后也明显不同。尽管膀胱癌根治术被认为是治疗侵润性膀胱癌(pT2-pT4)的金标准,但有50%的患者在术后2年内发生远处转移,而且大大降低了患者的生活质量,患者5年生存率不到50%。因此,寻求新的干预策略对提高膀胱癌的疗效具有特殊的迫切性和重要性。造成膀胱癌患者死亡的主要原因是膀胱癌的侵袭性。其侵袭过程中的一个重要因素是细胞外基质的降解,其中,起重要作用的是一类Zn2+依赖的基质金属蛋白酶MMPs (Matrix Metalloproteinases)。MMPs能够破坏局部组织结构和基底膜屏障,促进肿瘤的生长和转移,并且可促进肿瘤新生血管的形成。CD147亦称EMMPRIN,是单次跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。CD147在多种恶性肿瘤细胞中高表达,其表达水平和肿瘤的侵袭和转移等密切相关。CD147主要刺激肿瘤细胞和邻近的纤维母细胞分泌大量的MMPs,通过影响肿瘤的生长、侵袭、转移和血管形成等促进恶性肿瘤的侵袭和转移。CD147分子还可以通过旁分泌途径促进MMPs产生；在肿瘤细胞表面与MMP-1形成复合物,使肿瘤细胞表面局部MMPs聚集,有利于其发挥降解胶原作用,从而促进肿瘤细胞的侵袭。然而,CD147是否参与调节膀胱癌的侵润及转移过程尚未见报道。为了研究CD147和膀胱癌之间的关系,我们首先应用免疫组化检测CD147基因在膀胱癌组织中的表达情况,分析CD147与膀胱癌分期、分级等临床病理参数的关系,然后针对CD147构建了RNA干扰载体,观察其对离体膀胱癌T-24细胞侵袭的抑制作用,阐明膀胱癌进展的分子机制,为研究膀胱癌更有效的治疗手段提供理论和实验依据。研究方法1、免疫组化检测CD147在膀胱癌组织中的表达情况,分析CD147与膀胱癌分期、分级等临床病理参数的关系。2、CD147基因siRNA重组腺病毒载体(Ad-CD 147 siRNA)的构建及效果鉴定。(1)RT-PCR检测Ad-CD 147 siRNA对人膀胱癌T-24细胞CD147基因mRNA表达的影响。(2) Western Blot检测Ad-CD147 siRNA对人膀胱癌T-24细胞CD147基因蛋白表达的影响。3、Ad-CD147 siRNA对膀胱癌T-24细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响(1)MTT检测Ad-CD147 siRNA对T-24细胞增殖能力的影响。(2)划痕实验检测Ad-CD147 siRNA对T-24细胞迁移能力的影响。(3) Transwell检测Ad-CD147 siRNA对T-24细胞侵袭能力的影响。(4)明胶酶谱实验检测T-24细胞感染Ad-CD147 siRNA后MMP-2、MMP-9的分泌情况。(5) RT-PCR检测T-24细胞感染Ad-CD147 siRNA后VEGF mRNA表达水平。(6) ELISA检测T-24细胞感染Ad-CD147 siRNA后VEGF分泌水平。研究结果1、CD147在正常膀胱癌组织中无表达或表达非常微弱,相反,在膀胱癌组织中阳性表达率为73.6%(59／80),CD147表达于肿瘤细胞膜和细胞质中,此研究结果说明与正常膀胱组织相比,膀胱癌组织中CD147存在过度表达。不同分期、分级膀胱癌细胞着色结果分析发现,CD147表达与膀胱癌分期(P=0.033)、分级(P=0.028)相关,而与年龄(P=0.276)、性别(P=0.196)无关,说明膀胱癌细胞不仅表达CD147,并且其表达程度与膀胱癌恶性程度成正比。2、成功构建了针对CD147基因的siRNA重组腺病毒表达载体(Ad-CD 147 siRNA),RT-PCR和Western Blot结果显示,Ad-CD147 siRNA高效而特异地沉默了膀胱癌T-24细胞CD147基因的表达。MOI=100时,干扰效应达90%以上。3、MTT实验结果表明,Ad-CD147 siRNA感染T-24细胞3、4和5天后,细胞增殖水平显著下降,和未感染组(Mock)相比,其下降率分别为38%,41%和43%(P<0.01)。细胞划痕实验中,Ad-CD147 siRNA感染T-24细胞后,细胞迁移能力显著下降,Ad-CD147 siRNA感染组,阴性对照组(Ad-siControl)和未感染组(Mock)的细胞迁移距离分别为0.85mm、1.73 mm和1.8mm(P<0.01)。Transwell体外侵袭实验结果显示,Ad-CD 147 siRNA感染后,T-24细胞侵袭能力显著下降,与未感染组(Mock)和阴性对照组(Ad-siControl)相比,其侵袭能力分别分别下降了75%和70%(P<0.01)。明胶酶谱实验结果发现,与未感染组(Mock)相比,Ad-CD147 siRNA感染组MMP-2、MMP-9的分泌量分别下降了68.5%和37.1%(P<0.01). VEGF RT-PCR和ELISA结果发现,与未感染组(Mock)相比,Ad-CD 147 siRNA感染组显著下降了VEGF mRNA和蛋白表达水平,其下降率分别为57.2%和56.5%(P<0.01)结论1、CD147基因在膀胱癌组织中存在过度表达,其表达强度与膀胱癌的分期、分级相关,可能作为判断膀胱癌是否具备高转移潜能的指标。2、构建了CD147基因siRNA重组腺病毒载体。(1)感染T-24细胞,经RT-PCR和Western-Blot检测,CD147分子在mRNA和蛋白水平被阻断。(2)功能实验结果显示,RNAi较好地抑制了膀胱癌细胞的生物学行为。主要表现在：①细胞的增殖和迁移能力明显下降。②RNAi封闭的膀胱癌细胞自身分泌MMPs和VEGF的能力的能力大为减弱。③在MMPs和VEGF分泌量减少的情况下,膀胱癌细胞降解胶原和血管形成能力下降,侵袭力减弱。3、用siRNA阻断CD147基因的表达,有可能提供膀胱癌基因治疗的新的靶点,是膀胱癌治疗的一个新的方向。