前言：　　 卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤，化疗耐药是导致死亡率居高不下的原因之一。化疗在治疗卵巢癌及防止卵巢癌复发中占有重要地位，但化疗药物的副作用和化疗耐药在一定程度上限制了其临床应用。因此开发高效、特异性、副作用小的化疗制剂及减少化疗耐药成为研究的热点。　　 蛋白酶体抑制剂是一种新型抗肿瘤制剂。大量基础研究表明，蛋白酶体抑制剂对包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞具有杀伤作用，并能增强其对部分化疗制剂的敏感性。蛋白酶体抑制剂通过抑制泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasomesystem，UPS)中的蛋白酶体活性，影响UPS在细胞内的功能，从而发挥其抗肿瘤作用。　　 UPS和自噬-溶酶体通路(autophagy-lysosome pathway，ALP)是真核细胞清除蛋白质和细胞器的两个主要通路，长期以来被认为是不相关的两大蛋白降解途径，然而最新研究表明泛素-蛋白酶体系和自噬-溶酶体系紧密相关，互相调控。蛋白酶体功能的不足可激活自噬;自噬的激活可以补偿蛋白酶体功能的丧失;而去除自噬可以抑制蛋白酶体功能，导致泛素化蛋白的蓄积。　　 近年自噬被分为经典自噬和非经典自噬，它们的主要区别就是在形成自噬体的过程中是否需要整套的Atg（autophagy related gene，自噬相关基因）蛋白，其中最为典型的非经典自噬就是不依赖于Atg6（即哺乳动物细胞中的Beclin1）的自噬。Beclin1基因是哺乳动物参与自噬的双等位抑癌基因，其单倍体缺失是细胞发生恶性转化的原因之一。目前自噬基因Beclin1作为单倍体不足型的肿瘤抑制基因已经得到公认，与肿瘤的发生、发展关系密切。但Beclin1相关抑癌机制目前仍不很清楚，现有研究主要集中在Beclin1作为一种自噬基因具有诱导自噬，引起细胞发生自噬性程序性死亡及抗基因组突变的作用上。　　 我们的预实验表明蛋白酶体抑制剂MG132可以诱导卵巢癌细胞的死亡，并增加自噬作用。自噬激活后会出现两种不同的结果:一种是保护细胞防止周围环境带来的损害;另一种是启动细胞主动性的细胞死亡程序。目前自噬激活对蛋白酶体抑制剂抗肿瘤作用的影响还没有发现特定的规律。我们在前期研究基础上，探讨解析蛋白酶体抑制剂诱导卵巢癌细胞自噬的意义及机制，为临床合理应用蛋白酶体抑制剂提供理论依据。　　 方法：　　 第一部分:蛋白酶体抑制剂分别处理卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2870细胞后，MTT法检测细胞存活率;荧光显微镜下观察Hoechst33258染色的细胞核形态变化;Western blot法检测凋亡相关蛋白PARP及其裂解物的表达变化;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪分析检测细胞凋亡。　　 第二部分:蛋白酶体抑制剂分别处理卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2870细胞后，AO荧光染色，观察细胞内酸性囊泡数量及结构的变化;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达;实时定量PCR检测Beclin1 mRNA的表达。应用shRNA敲低卵巢癌细胞的早期自噬关键基因Atg7、或巴弗洛霉素A1抑制自噬晚期的自噬溶酶体形成后，Western blot检测蛋白酶体抑制剂处理后LC3的表达变化。分别采用Ⅲ型PI3K抑制剂处理卵巢癌细胞或Beclin1特异性shRNA(shBeclin1)转染卵巢癌细胞后，AO荧光染色，观察蛋白酶体抑制剂处理后细胞内酸性囊泡数量及结构变化;Western blot检测蛋白酶体抑制剂处理后LC3的表达变化。　　 第三部分:Beclin1真核质粒分别转染卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2870细胞，蛋白酶体抑制剂处理后，MTT法检测细胞存活率;荧光显微镜下观察Hoechst33258染色的细胞核形态变化;Western blot检测凋亡相关蛋白PARP及其裂解物的表达变化。应用Atg7特异性shRNA(shAtg7)转染抑制OVCAR3细胞的早期自噬、或晚期自噬抑制剂处理卵巢癌细胞，MTT法检测蛋白酶体抑制剂处理后细胞存活率的变化。　　 结果：　　 第一部分:蛋白酶体抑制剂分别处理卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2870细胞后，MTT法结果发现细胞存活率呈现浓度依赖性下降;荧光显微镜下观察发现Hoechst33258染色的细胞核凋亡增加;Western blot结果显示凋亡相关蛋白PARP下降，而其裂解物的表达增加;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析结果显示细胞凋亡增加。　　 第二部分:蛋白酶体抑制剂分别处理卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2870细胞后，AO荧光染色，观察发现细胞内酸性囊泡增多;Western blot结果显示自噬相关蛋白LC3Ⅰ型向Ⅱ型的亚型转化增加，而Beclin1表达下降;实时定量PCR结果显示Beclin1 mRNA的表达水平无差异。敲低卵巢癌细胞早期自噬关键基因Atg7后，蛋白酶体抑制剂诱导的LC3Ⅰ型向Ⅱ型转化下降;而抑制晚期自噬溶酶体形成后，该转化增加。抑制Ⅲ型PI3K或敲低卵巢癌细胞中Beclin1的表达，发现蛋白酶体抑制剂处理后细胞内酸性囊泡无明显变化;LC3亚型间转化亦无明显变化。　　 第三部分:Beclin1真核表达质粒分别转染卵巢癌SKOV3、OVCAR3、A2870细胞，蛋白酶体抑制剂处理后，MTT结果发现细胞存活率下降;荧光显微镜下观察发现细胞核凋亡增加;Western blot检测发现凋亡相关蛋白PARP下降，而其裂解物的表达增加。应用Atg7特异性shRNA(shAtg7)转染OVCAR3细胞抑制早期自噬、或晚期自噬抑制剂处理卵巢癌细胞，MTT法检测显示蛋白酶体抑制剂处理前后细胞的存活率无明显变化。　　 结论：　　 1.蛋白酶体抑制剂对卵巢癌细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用。　　 2.蛋白酶体抑制剂诱导卵巢癌细胞发生自噬，但该过程不依赖于Ⅲ型PI3K/Beclin1途径。　　 3.Beclin1非自噬依赖性增强蛋白酶体抑制剂对卵巢癌细胞的毒性作用。