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随着人们生活水平的提高,肥胖人数和人口老龄化的增加,糖尿病（Diabetes mellitus,DM）的发病率逐年上升。据世界卫生组织（WHO）的数据分析,预计2030年,全球DM患者人数将比2000年翻一倍,预计将达3.80亿。中国DM人数也呈现快速增长趋势,2007年中国DM人数约为3980万,2010年DM患者已有超过9240万,中国成为全球DM第一大国。预计到2025年,中国DM人数将达到5930万[1-3]。糖尿病的严重微血管并发症之一糖尿病肾病,发病率为6.5%～42%,由糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）导致的终末期肾病正在逐年上升,糖尿病肾病是目前欧美等发达国家终末期肾病的首要病因,也是中国终末期肾病的第二大病因,是我国终末期肾病的第一病因。肾间质纤维化是DN的最终过程,其主要特征是肾小管萎缩,肾间质纤维化。肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展到终末期肾衰时的共同途径和主要的病理改变[4]。并且目前在对肾间质纤维化的研究中发现,自噬异常可能是导致肾间质纤维化发生的最重要的机制之一[5～10]。糖尿病肾病时损伤的固有细胞能否有效的修复是决定疾病转归的关键。自噬是一种细胞自我保护机制,自噬可在细胞能量不足情况下,消化蛋白质及脂质为细胞提供能量,且可清除老化或异常折叠蛋白质,清除损伤细胞器的作用。自噬是一切细胞在应激状态下自我修复的关键。高血糖和糖基化终末产物等引起肾脏固有细胞自噬损伤,尤其是肾小管上皮细胞自噬损伤,近年来受到了广泛的关注。生理状态下,肾小管上皮细胞存在基础水平的自噬,其主要目的在于清除长寿蛋白和衰老受损的细胞器。研究已证实mTOR信号通路是自噬的主要抑制通路之一,在自噬的发生及发展中发挥重要作用,且mTOR的上游通路蛋白AMPK磷酸化增加可抑制mTOR,进而增强自噬。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是生物体内一个重要的蛋白激酶,也是协调物质和能量代谢的关键酶,其可通过激活磷酸化自噬相关基因Ulk1促进自噬发生[11]。雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammaliantarget of rapamycin,mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可调控细胞生长、增殖与能量代谢,抑制自噬发生。细胞内mTOR 主要以 mTOR 复合体 1（mTOR Complex 1,mTORC1）和mTOR复合体2（mTOR Complex 2,mTORC2）两种形式存在,mTORC1对雷帕霉素敏感,被认为是转录非依赖的自噬调节子。在营养丰富的情况下,mTORC1直接磷酸化并抑制包括Atg13、ULK1在内的自噬所涉及的Atg蛋白,使它们的结合能力减弱,从而抑制自噬复合物ULK1-Atg13-Atg17的形成,抑制自噬[12];在饥饿情况下,mTORC1没有活性,从ULK复合物上分离出来,诱发自噬的发生[13]。AMPK/mTOR通路作为能量调控器,不仅在调节肝脏、脂肪和骨骼肌的糖脂代谢方面发挥着重要的作用,而且可以调节肾脏内的自噬水平。DN状态下,高血糖和糖基化终末产物等可激活AMPK/mTOR信号转导通路,抑制自噬,加重DN进程。导师赵宗江教授提出“肾痿”学说,DN病情迁延则热、郁、痰湿、瘀血、毒邪相互胶结于肾脏,阻滞气血运行,使肾脏的结构破坏,“肾体”受损,肾脏的结构破坏必然最终导致肾脏正常功能受损甚至丧失,即“肾用”失常,“肾肾体”和“肾用”均受到损害,肾脏痿废不用,终至“肾痿”。本研究采用DNKKAy小鼠和小鼠肾小管上皮细胞为研究对象,采用免疫荧光、免疫组化、原位杂交、Western blot、RT-PCR和Real Time PCR方法,从动物实验和体外细胞实验两个角度探讨糖肾平对DN肾脏的保护作用和AMPK/mTOR信号通路关键分子表达的影响,为“肾痿”学说提供新的实验依据。目的:观察糖肾平对DNKKAy小鼠的氧化应激和肾脏保护的影响,运用免疫组化和原位杂交技术观察糖肾平对肾组织中LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白及mRNA表达的影响;体外细胞实验运用免疫荧光技术、Western blot和Real Time PCR观察糖肾平对肾小管上皮细胞LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白和mRNA表达的影响。方法:1.糖肾平防治DN KKAy小鼠药效学作用SPF级雌性8～10周龄KKAy小鼠60只,C57BL/6J小鼠10只。KKAy小鼠喂食高脂高蛋白饲料,C57BL/6J小鼠喂食普通饲料。KKAy小鼠用KK鼠配合饲料喂食,C57BL/6J小鼠喂食普通饲料。血糖≥16.7mmol/L24h,尿蛋白≥0.4mg,为诱导糖尿病肾病动物模型成功。模型成功的KKAy小鼠根据血糖和体重,以分层随机分为模型组,厄贝沙坦组,糖肾平小、中、大剂量组,灌胃给药。记录实验小鼠的一般情况,体质量称重,收集24小时尿量,检测尿蛋白定量。各组所有小鼠于26周摘眼球取血,测血糖、甘油三酯（Triglyeride,TG）、肌酐（Serum creatinine,Scr）和尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）;小鼠肾脏称重,计算肾重/体重比;小鼠肾石蜡包埋并切片,做HE、Mallory和PAS染色,分析小鼠肾脏的病理学变化。2.比色法:检测小鼠血清丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）含量。3.免疫荧光:检测小鼠肾小管上皮细胞中LC3、P62蛋白的表达水平。4.免疫组化:检测小鼠肾组织中LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白的表达水平。5.原位杂交:检测小鼠肾组织中LC3和P62 mRNA的表达水平。6.Western blot:检测体外培养的小鼠肾小管上皮细胞中LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白的表达水平。8.Real Time PCR:检测体外培养的小鼠肾小管上皮细胞中LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR mRNA 的表达水平。9.所有的实验数据用SPSS 22.0进行统计分析。结果:1.糖肾平对DN KKAy小鼠药效学的影响与模型组相比,糖肾平小、中、大剂量组的小鼠一般状态得到改善,体质量有不同程度减轻不同程度降低,治疗16周后,糖肾平大剂量组小鼠体质量明显减轻（P<0.01）,肾质量与体质量比值明显降低（P<0.01）,24h尿蛋白定量明显减少（P<0.01）,血清BUN含量明显降低（P<0.01）,TG、Scr含量降低（P<0.05）,肾脏病理改变明显减轻。2.糖肾平对DN KKAy小鼠氧化应激的影响模型组小鼠MDA水平与正常对照组比较显著升高（P<0.01）,模型组NO和SOD水平与正常对照组比较明显降低（P<0.01）。与模型组相比,糖肾平小、中、大剂量组血清中的NO、SOD含量显着升高（P<0.01）,同时MDA含量显着降低（P<0.01）。3.糖肾平对 DNKKAy 小鼠肾组织 LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白表达的影响免疫组化:（1）LC3蛋白:正常组肾小管上皮细胞胞质内LC3蛋白表达量较多,明显高于模型组的表达量（P<0.01）;与模型组比较,除糖肾平小剂量组外,各治疗组肾小管上皮细胞LC3蛋白表达显着增多（P<0.01）,糖肾平中剂量和大剂量组增多最明显。（2）P62蛋白:正常对照组肾小管上皮细胞有少量P62蛋白表达,明显低于模型组（P<0.01）;与模型组比较,除糖肾平小剂量组,各治疗组肾小管上皮细胞P62蛋白表达均明显降低（P<0.05）。（3）AMPK、P-AMPK蛋白和P-AMPK/AMPK:AMPK蛋白表达各组未见明显差异（P>0.05）。正常组肾小管上皮细胞P-AMPK蛋白表达量较多,明显高于模型组（P<0.01）;与模型组比较,除糖肾平小剂量组外,各治疗组肾小管上皮细胞P-AMPK蛋白表达增多（P<0.01）,糖肾平中剂量和大剂量组增多明显。P-AMPK/AMPK:与正常对照组比较,模型组P-AMPK/AMPK降低（P<0.01）;与模型组比较,除糖肾平小剂量组外,各治疗组肾小管上皮细胞P-AMPK/AMPK升高（P<0.01）,糖肾平中剂量和大剂量组升高明显。（4）mTOR、P-mTOR蛋白和P-mTOR/mTOR:mTOR蛋白各组表达未见明显差异（P>0.05）。正常对照组肾小管上皮细胞有少量P-mTOR蛋白表达,明显低于模型组（P<0.01）;与模型组比较,除糖肾平小剂量组,各治疗组肾小管上皮细胞P62蛋白表达均明显降低（P<0.05）。P-mTOR/mTOR:正常对照组比较,模型组P-mTOR/mTOR升高（P<0.01）。与模型组比较,各治疗组比值降低（P<0.05）。以糖肾平大剂量组最为明显。4.糖肾平对DNKKAy小鼠肾组织LC3 mRNA表达的影响原位杂交:与正常对照组比较,模型组LC3 mRNA表达减少（P<0.01）。与模型组比较,厄贝沙坦组、糖肾平中剂量组及大剂量组小鼠肾小管上皮细胞LC3mRNA表达增多（P<0.01）。与厄贝沙坦组比较,糖肾平小剂量组LC3 mRNA表达减少（P<0.01）。与糖肾平大剂量组比较,糖肾平小剂量组LC3 mRNA表达减少（P<0.01）。5.免疫荧光检测糖肾平对高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞LC3、P62表达的影响免疫荧光:正常组肾小管上皮细胞LC3蛋白表达较多,明显高于高糖组（P<0.01）;与高糖组比较,糖肾平中剂量和大剂量LC3蛋白表达量增多（P<0.05）;与正常组比较,高糖组P62蛋白表达增多（P<0.01）。与高糖组比较,糖肾平中及大剂量组、雷帕霉素组、厄贝沙坦组P62蛋白表达减少（P<0.01）。6.糖肾平对体外高糖诱导肾小管上皮细胞LC3、P62、P-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白表达的影响Western blot:（1）LC3蛋白:正常组肾小管上皮细胞高表达LC3明显高于高糖组（P<0.01）;与高糖组比较,糖肾平中、大剂量组,雷帕霉素组,厄贝沙坦组肾小管上皮细胞LC3蛋白表达显着增加（P<0.05）。（2）P62蛋白:与正常组比较,高糖组肾小管上皮细胞P62蛋白表达增多（P<0.01）。与高糖组比较,除糖肾平小剂量组外,其余治疗组及雷帕霉素组表达较少（P<0.01）,以糖肾平中剂量和大剂量组最为明显。（3）AMPK、P-AMPK 和 P-AMPK/AMPK:AMPK 蛋白表达未见明显差异（P>0.05）。与正常组比较,高糖组P-AMPK减少（P<0.01）。与高糖组比较,糖肾平中剂量组和大剂量组,雷帕霉素组、厄贝沙坦组P-AMPK蛋白表达增多（P<0.05）。与正常组比较,高糖组P-AMPK/AMPK蛋白表达量的比值降低（P<0.01）。与高糖组比较,糖肾平中剂量组和大剂量组P-AMPK/AMPK蛋白表达量的比值升高（P<0.05）。（2）mTOR、P-mTOR和 P-mTOR/mTOR:mTOR 蛋白表达未见明显差异（P>0.05）。与正常组比较,高糖组P-mTOR蛋白表达增多（P<0.01）。与高糖组比较,除糖肾平小剂量组外,其余治疗组及雷帕霉素组表达降低（P<0.01）,治疗组中以糖肾平大剂量降低最为明显。与正常组比较,高糖组P-mTOR/mTOR蛋白表达量升高（P<0.01）。与高糖组比较,糖肾平中剂量组、糖肾平大剂量组、雷帕霉素组、厄贝沙坦组P-mTOR/mTOR蛋白表达量降低（P<0.01）。6.糖肾平对体外高糖诱导肾小管上皮细胞LC3、P62、AMPK、mTOR mRNA表达的影响Real Time PCR:（1）LC3 mRNA:正常组肾小管上皮细胞高表达LC3明显高于高糖组（P<0.01）;与高糖组比较,糖肾平中、大剂量组,雷帕霉素组,厄贝沙坦组肾小管上皮细胞LC3蛋白表达显着增加（P<0.05）。（2）P62mRNA:与正常组比较,高糖组肾小管上皮细胞P62mRNA表达增多（P<0.01）。与高糖组比较,除糖肾平小剂量组外,其余治疗组及雷帕霉素组表达较少（P<0.01）,以糖肾平中剂量和大剂量组最为明显。（3）AMPK mRNA:正常组、高糖组及各治疗组AMPK mRNA表达未见明显差异（P>0.05）。（4）mTOR mRNA:正常组、高糖组及各治疗组AMPK mRNA表达未见明显差异（P>0.05）。结论1.糖肾平可以改善DNKKAy小鼠的一般状态,改善DN氧化应激状态,减轻糖尿病肾病小鼠体质量、肾重体重比、24h尿蛋白定量、血糖及血清BUN、Scr、TG,延缓DN进程,其疗效呈剂量依赖型;2.糖肾平可通过降低DNKKAy小鼠血清MDA含量,升高NO、SOD含量,改善DN KKAy小鼠氧化应激状态,达到保护肾功能的目的;3.糖肾平可通过干预糖尿病肾病KKAy小鼠肾组织AMPK/mTOR信号转导通路,上调LC3、P-AMPK,下调P62、P-mTOR表达,提高肾组织自噬水平,改善DN作用;4.糖肾平可通过干预高糖培养肾小管上皮细胞AMPK/mTOR信号转导通路上LC3、P-AMPK、P62、P-mTOR蛋白及基因表达,从而提高高糖培养肾小管上皮细胞自噬水平。